利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù).docx

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1、利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)：像數(shù)1，2，3那樣簡(jiǎn)單許多關(guān)于細(xì)胞利用的一些生物學(xué)應(yīng)用，如微生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、血液檢查等要求我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞的濃度。細(xì)胞計(jì)數(shù)非常簡(jiǎn)單，需要有一個(gè)計(jì)數(shù)板，稱為血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。19世紀(jì)法國解剖學(xué)家Louis-CharlesMalassez發(fā)明了這種血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是由一片較厚的特制玻片構(gòu)成，中間有一個(gè)垂直線網(wǎng)格。網(wǎng)格的尺寸是給定的，因此每條線覆蓋的區(qū)域是已知的，這樣就可以對(duì)一定體積內(nèi)的溶液中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，為后期的血細(xì)胞檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。最為常見的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板類型的中部有一個(gè)“H”形結(jié)構(gòu)，上面有兩個(gè)

2、像鏡子一樣拋光的網(wǎng)格表面，并可在上面加上外罩。加載血細(xì)胞計(jì)數(shù)板開始進(jìn)行計(jì)數(shù)之前，用擦鏡紙拭去灰塵顆粒，確保血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及其蓋玻片處于潔凈狀態(tài)。安裝在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上的蓋玻片是特制的，明顯厚于傳統(tǒng)的顯微鏡蓋玻片，這是因?yàn)樗仨毮軌蚩朔旱蔚谋砻鎻埩Α４_保在加載細(xì)胞懸液之前，先將蓋玻片放置在計(jì)數(shù)表面，然后將吸液頭和樣本放進(jìn)其中的一個(gè)V型孔中，并小心地?cái)D出樣本。利用毛細(xì)管作用充填蓋玻片下部的區(qū)域。必須放入足夠的液體以便覆蓋整個(gè)鏡片的表面，通常需要大約10ul，但不要溢出表面。您可以在一臺(tái)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中加載兩個(gè)樣本，每個(gè)樣本進(jìn)入兩個(gè)網(wǎng)格。將加載完的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板放

3、置在顯微鏡臺(tái)上，然后將計(jì)數(shù)格在低倍鏡焦距中顯示。將樣本靜置幾分鐘，不要移動(dòng)蓋玻片，以免產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致計(jì)數(shù)困難。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)一個(gè)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的整個(gè)網(wǎng)格包括9個(gè)方格，每個(gè)方格的面積為1mm2。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的中心區(qū)域有25個(gè)較大的方格，每個(gè)大的方格中又包含16個(gè)小方格。當(dāng)進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，僅對(duì)那些位于大方格兩側(cè)的各行中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以避免重復(fù)計(jì)數(shù)。懸液必須稀釋到足夠的程度，這樣，細(xì)胞或其它顆粒才能均勻分布，不會(huì)再網(wǎng)格中相互重疊。為了判斷細(xì)胞的活性，通常采用一種特殊的染色劑（如用臺(tái)盼藍(lán)稀釋樣本）。這種染色方法，又稱為染色排除法，選用一種重氮染料，它

4、可以進(jìn)入死細(xì)胞的細(xì)胞膜，將它們?nèi)境伤{(lán)色；而這種染料不會(huì)被活細(xì)胞的細(xì)胞膜所吸收，由此，活細(xì)胞不會(huì)被染色。當(dāng)在顯微鏡下進(jìn)行觀察時(shí)，死細(xì)胞呈深藍(lán)色。為了進(jìn)行計(jì)數(shù)，需要確定在所選的方格內(nèi)識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞類型并計(jì)算系統(tǒng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)所需的放大倍數(shù)，這樣總計(jì)數(shù)大約為100個(gè)，這是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性計(jì)數(shù)所需的最低細(xì)胞數(shù)量。對(duì)于較大的細(xì)胞，您只需對(duì)角上的四個(gè)和中間的一個(gè)大方塊中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)即可。對(duì)于小細(xì)胞的濃懸浮液，您可能希望對(duì)中間方格的4個(gè)外部和中間的方格進(jìn)行計(jì)數(shù)，或進(jìn)一步稀釋懸液。切記！如果存在細(xì)胞與邊線重疊的情況，若與頂部或右側(cè)邊線重疊，其計(jì)算在“內(nèi)”；若與底部或左側(cè)邊線重

5、疊，其計(jì)算在“外”。如果中間區(qū)域和每個(gè)角落的方格為1mmx1mm=1mm2:每個(gè)方格的深度為0.1mm。每個(gè)方格在該深度的最終體積為100nl。一旦您獲得了細(xì)胞計(jì)數(shù)的總數(shù)，可以通過下列公式計(jì)算細(xì)胞濃度：細(xì)胞總數(shù)/ml＝統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞總數(shù)×（稀釋因子/方格數(shù)）×10，000細(xì)胞/ml因此，如果您用1:1的臺(tái)盼藍(lán)對(duì)樣本進(jìn)行稀釋，并在4個(gè)角落的方格加上中間大方格中統(tǒng)計(jì)得到325個(gè)細(xì)胞，則每毫升（ml）中細(xì)胞總數(shù)=：325個(gè)細(xì)胞×[2(稀釋因子)/5個(gè)方格]×10，000細(xì)胞/ml=130×104細(xì)胞/ml如果您想知道原先樣本中有多少細(xì)胞，只需用總的樣本量乘以細(xì)胞

6、濃度即可。例如，如果您原先的樣本量是5ml，則您的樣本中總計(jì)擁有=:130×104細(xì)胞/ml×5ml=650×104個(gè)細(xì)胞