資源描述：
《產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的篩選.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的篩選組長：高鴻飛組員：劉光明，何笑軍，董慧，王志昆，胡明慧（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶）【摘要】：以從西南大學(xué)各處土壤中分離得到的黑曲霉作為出發(fā)菌株，并對其進(jìn)行了初步分離。利用酸分離法和變色圈法進(jìn)行初步篩選，以產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱作為復(fù)篩指標(biāo)，篩選到了一株穩(wěn)定，高產(chǎn)檸檬酸的優(yōu)勢菌株。并利用正交實驗法優(yōu)選檸檬酸產(chǎn)生菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，紫外誘變育種法探究高產(chǎn)菌誘變的較佳時間?！娟P(guān)鍵詞】：黑曲霉；酸分離法；變色圈法；篩選；正交試驗；誘變檸檬酸又名枸櫞酸，是目前以微生物發(fā)酵生產(chǎn)的重要有機(jī)酸之一。產(chǎn)檸檬酸的微生物包括真菌、細(xì)菌和酵母，黑曲霉是迄今
2、為止產(chǎn)檸檬酸最佳的微生物之一。本次實驗的目的是從土壤中篩選檸檬酸的黑曲霉高產(chǎn)菌株，并對其培養(yǎng)基的配置及最佳產(chǎn)酸條件進(jìn)行探索，為今后進(jìn)一步完善和優(yōu)化其篩選工藝提供一定理論依據(jù)。1材料與方法1.1實驗材料1.1.1出發(fā)菌種從西南大學(xué)食堂周圍，山頂，試驗田土壤中分離獲得。1.1.2培養(yǎng)基察氏培養(yǎng)基成分硝酸鈉 3g 磷酸氫二鉀 1g 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g 氯化鉀 0.5g 硫酸亞鐵 0.01g 蔗糖 30g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000mL 制法：加熱溶解，分裝后121℃滅菌20min。1.1.3其他檸檬酸，可
3、溶性淀，Deniges試劑，蔗糖NH4NO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O，溴甲酚綠指示劑，氫氧化鈉溶液，KMn044溶液1.2實驗方法1.2.1黑曲霉篩選的流程土壤→稀釋分離→變色圈平板→挑菌→純化→搖瓶初篩→產(chǎn)物鑒定→復(fù)篩→正交實驗→最優(yōu)組合→誘變育種1.2.2黑曲霉的分離與鑒定采集表層以下5-10cm處土壤，稱1.0g土壤迅速倒入裝有玻璃珠的無菌水三角瓶中，配成10-2的土壤菌懸液，然后用移液管將其稀釋到10-3、10-4、10-5倍。分別吸取10-3、10-4、10-5倍稀釋液注入到酸分離培養(yǎng)基上以及涂布到察氏瓊脂培養(yǎng)基上，靜
4、置5min后倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)35℃培養(yǎng)3-4d，觀察菌落形態(tài)特征，挑選出黑曲霉疑似菌株。1.2.3黑曲霉的初篩將上述所得菌種連續(xù)劃線接種到初篩培養(yǎng)基平板上，在37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4d后，發(fā)現(xiàn)菌落周圍有黃色的變色圈（溴甲酚綠指示劑遇酸會產(chǎn)生顏色反應(yīng)）?？焖贉y定菌落及周圍變色圈直徑的大小，選擇生長較快、變色圈與菌落直徑之比相對較大者作為初篩菌株。并利用Deniges試劑(HgO1g溶于20ml0.2L／LH2S04中)鑒定檸檬酸和用0.1429mol/L的NaOH測定產(chǎn)酸量1.2.4黑曲霉的復(fù)篩將初篩到的黑曲霉（變色圈明顯）接種到搖瓶培
5、養(yǎng)基中，發(fā)酵3-5d，重復(fù)培養(yǎng)一次。然后用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定10mL的發(fā)酵液，記錄各自消耗NaOH的體積和計算產(chǎn)酸量。采用正交試驗確定培養(yǎng)基濃度。選取四個主要影響因素：蔗糖、NH4NO、KH2PO4，MgSO4·7H2O每個因素各取三個水平，采用四因素三水平進(jìn)行正交試驗L9(34)以優(yōu)勢黑曲霉所產(chǎn)檸檬酸的產(chǎn)酸量為評價指標(biāo)。這樣各個營養(yǎng)成分的濃度也就較為容易地確定下來了。1.2.5檸檬酸鑒定及產(chǎn)酸量的測定檸檬酸鑒定
利用Deniges試劑(HgO1g溶于20ml0.2L／LH2S04中)；取過濾液和對照液各約5ml，放入
6、試管內(nèi)，加Deniges液lml，在酒精燈上緩緩加熱至沸。逐滴加入20g／LKMn04溶液。若有檸檬酸存在，則出現(xiàn)白色沉淀。產(chǎn)酸量的測定，方法如下：
將過濾液充分搖勻，取10mL于150mL錐形瓶中，滴加2滴酚酞作指示劑，0.1429mol/LNaOH滴定酸度。1.2.6紫外照射誘變育種紫外誘變基本流程示意圖：
水洗稀釋成106個/ml
出發(fā)菌株→孢子懸浮液→待處理液
紫外線射分離單孢子點種
處理液→平板→培養(yǎng)成熟→平板
選菌搖瓶培養(yǎng)
→培養(yǎng)成熟→測酸度2結(jié)果與分析2.1在初篩培養(yǎng)基上用肉眼觀察菌落特征：平板培養(yǎng)基上初為白色、平坦，后中
7、心微隆變黃色，再變棕黑色。培養(yǎng)3-4d后然后挑取平板上單菌落的菌株黑色的孢子絲到顯微鏡上觀察。查文獻(xiàn)可知菌絲特點為：初生菌絲為白色，菌絲較長，呈絨毛狀；基內(nèi)菌絲透明，有橫隔；部分菌絲特化的壁厚、膨大的足細(xì)胞，頂囊明顯膨大，多成球形，表面生輻射壯小梗，頂端分生孢子串生。但實驗中并未觀察到。2.2黑曲霉的初篩由于初篩培養(yǎng)基中加有溴甲酚綠指示劑，黑曲霉產(chǎn)檸檬酸與之反應(yīng)，在菌落周圍形成一個透明的變色圈。變色圈與菌落直徑比例大小對產(chǎn)酸的影響，見表1。表1變色圈與菌落直徑比例大小對產(chǎn)酸的影響菌落序號變色圈直徑/菌落大小產(chǎn)酸量A11.70.07A22.3
8、0.15一般認(rèn)為，變色圈與菌落直徑比例越大，菌株的產(chǎn)酸能力越強(qiáng)。這是因為透明的變色圈是檸檬酸與溴甲酚綠反應(yīng)的旺盛、產(chǎn)酸能力強(qiáng)。2.3黑曲霉的復(fù)篩復(fù)篩的主要目的：①考查菌株生產(chǎn)能力
