淀粉酶純化與活性測(cè)定.doc

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1、淀粉酶純化與活性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．了解淀粉酶對(duì)不同底物的專一性；2．了解溫度對(duì)酶的影響；2．掌握測(cè)定淀粉酶活力的原理和基本方法。二、基本知識(shí)與原理1．酶的概念自然界中的一切生命現(xiàn)象都與酶的活動(dòng)有關(guān)系?；罴?xì)胞內(nèi)全部的生物化學(xué)反應(yīng)都是在酶的催化作用下進(jìn)行的。如果離開(kāi)了酶，新陳代謝就不能進(jìn)行，生命就會(huì)停止。酶是生物體活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化活性的生物大分子，包括蛋白質(zhì)及核酸，又稱為生物催化劑。絕大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，少數(shù)的酶是RNA。2.酶的性質(zhì)酶是生物催化劑，除了具有化學(xué)催化劑的特性（例如只需微量就可以使所催化的反應(yīng)加速進(jìn)行，而其本身的質(zhì)和量都不發(fā)生變化）以外，還具

2、有一些不同于化學(xué)催化劑的特性。（1）酶的催化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)化學(xué)催化劑；（2）酶具有高度的專一性：（3）同一般的催化劑相比，酶很容易失活。3．影響酶活力因素酶的催化作用，受到溫度、pH和某些化合物等因素的影響。（1）溫度的影響?在一定的溫度范圍（0~40℃）內(nèi)，酶催化作用速度隨著溫度的升高而加快。但超過(guò)60℃，絕大多數(shù)的酶就會(huì)失去活性。（2）pH的影響?酶對(duì)環(huán)境中的pH十分敏感，只有在一定的pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出活性，超過(guò)這個(gè)范圍，酶就失活了。一般酶的最適pH在4~8之間。（3）激活劑和抑制劑的影響?有些物質(zhì)（大都是離子或簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物），能夠增強(qiáng)酶的活性；有些物

3、質(zhì)能夠抑制酶的活性。5．淀粉酶淀粉酶能作用于淀粉中的α-1,4葡萄糖苷鍵，使淀粉分解為麥芽糖。反應(yīng)方程式如下：2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11但是不能作用于蔗糖分子的α-D吡喃葡萄糖的C1和b-D-呋喃果糖的C2之間的糖苷鍵。淀粉的還原性極小，而唾液淀粉酶（主要含α-淀粉酶）水解淀粉后形成的麥芽糖有還原性，能使3,5-二硝基水楊酸（DNS試劑）還原成棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸。據(jù)此可以檢驗(yàn)蔗糖和淀粉有無(wú)被唾液淀粉酶水解，從而了解酶作用的專一性。6.??????酶活力也稱酶活性，是以酶在最適溫度、最適pH條件下，催化一定的化學(xué)反應(yīng)的初速度

4、來(lái)表示。本實(shí)驗(yàn)是以一定量的唾液淀粉酶液，于37℃、pH6.8的條件下，在一定的初始作用時(shí)間里將淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖，然后通過(guò)與DNS試劑作用，比色測(cè)定，求得還原糖的生成量，從而計(jì)算出酶反應(yīng)的初速度，即酶的活力。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液的棕色深淺與還原糖的含量成正比，在波長(zhǎng)540nm處測(cè)定溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液濃度得吸光度，便可求得樣品中還原糖得含量。三、實(shí)驗(yàn)器材1．實(shí)驗(yàn)材料：淀粉酶液2．實(shí)驗(yàn)試劑：可溶性淀粉、二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH6.8）、1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液3．實(shí)驗(yàn)設(shè)備：洗瓶、試管架、玻棒、水浴鍋、分光光度計(jì)四、實(shí)驗(yàn)步驟

5、1．唾液淀粉酶的制備（1）提?。合扔盟谇鍧嵖谇?，然后含1小口（約5ml）蒸餾水于口中輕漱1~2min。（2）過(guò)濾：將口腔中的酶提取液用一層脫脂棉過(guò)濾。（3）稀釋：取濾液1ml，用水定容至50ml。作為淀粉酶的樣品?！粲捎诓煌嘶蛘咄蝗瞬煌瑫r(shí)間收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀釋倍數(shù)可以是50~300倍，甚至超過(guò)此范圍。2．唾液淀粉酶的專一性實(shí)驗(yàn)取4支試管，按表5.1編號(hào)并記錄所觀察到的顏色。表5.1唾液淀粉酶的專一性實(shí)驗(yàn)和酶活測(cè)定管號(hào)操作123455pH6.8緩沖液（ml）121121蔗糖溶液（ml）110000淀粉溶液（ml）001111淀粉酶液（m

6、l）101000煮沸過(guò)的唾液（ml）000100標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（ml）000001酶促反應(yīng)搖勻，37℃水浴3minDNS試劑（ml）各2顯色反應(yīng)沸水浴5min顏色A500nm光吸收值3．唾液淀粉酶活力的測(cè)定用5號(hào)空白管座對(duì)照：在500nm處測(cè)定3、5管的吸收值。將數(shù)據(jù)填入表5.1。4.計(jì)算根據(jù)溶液濃度與光吸光值成正比的關(guān)系，即：A標(biāo)準(zhǔn)＝c標(biāo)準(zhǔn)則c（酶液管中麥芽糖濃度）＝A酶×c酶A酶c酶A標(biāo)準(zhǔn)（其中c為濃度，A為吸光值）本實(shí)驗(yàn)規(guī)定：在37℃、pH6.8的條件下，每3min水解淀粉釋放1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位。總活力單位＝c酶×n酶（c酶為麥芽糖的濃

7、度；n酶為稀釋倍數(shù)）附：分光光度計(jì)的使用：（1）先了解儀器的各個(gè)操作旋鈕的功能和電表的讀數(shù)方法。（2）開(kāi)啟電源，指示燈亮，選擇開(kāi)關(guān)置于“T”，波長(zhǎng)調(diào)置使用波長(zhǎng)。打開(kāi)比色皿暗箱蓋（光門自動(dòng)關(guān)閉），預(yù)熱20min后。（3）將預(yù)先裝好空白溶液和待測(cè)液的比色杯，依次放入暗箱內(nèi)的比色皿架上?！舯壬兴⑷芤翰灰诉^(guò)滿，大概2/3體積，若不慎使溶液流出比色杯外面，應(yīng)用濾紙吸干，再用擦鏡紙擦凈后才能放入比色杯架內(nèi)。◆手不能接觸比色杯的光滑面，切忌用濾紙等物擦拭比色杯的光滑面。（4）打開(kāi)暗箱蓋，調(diào)節(jié)“0”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。蓋上暗箱蓋，將對(duì)照液處于校正位置，使光電

8、管受光，調(diào)節(jié)透光率“100”旋鈕，使數(shù)