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《抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒(PNP比色法).doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測試劑盒(PNP比色法)簡介：酸酸性磷酸酶(acidphosphatase，ACP)分布極廣泛，遍布各種組織，主要存在于細胞的溶酶體內(nèi)，所以常作為溶酶體標志酶。溶酶體外的酸性磷酸酶存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)內(nèi)，各種動物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶適宜pH。存在于正常人肺泡巨噬細胞和白血病人脾臟的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistntacidphosphatase，TRAP)均在細胞濾泡中，并不是釋放入血液，血液中的TRAP絕大多數(shù)來源于破骨細胞，因此可以通過測量血液中的TRAP了解破骨細胞的功能狀態(tài)，幾乎被認
2、為是是機體破骨活性的唯一血液指標。TRAP一種糖基化的含金屬蛋白酶，在破骨細胞(osteoclast)和破軟骨細胞(chondroclast)中高表達，在活化的巨噬細胞和神經(jīng)元中也有表達。Leagene抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測試劑盒(PNP比色法)(TartrateResistntAcidPhosphataseColorimetricAssayKit)檢測原理是利用Para-nitrophenylphosphate(pNPP)為一種常用的磷酸酶顯色底物，在酸性條件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在堿性條件下p-nitr
3、ophenol呈黃色，產(chǎn)物黃色越深，說明酸性磷酸酶活性越高，反之則酶活性越低，通過分光光度計測定吸光度，據(jù)此通過比色分析就可以計算出酸性磷酸酶活性水平。在適量的酒石酸存在的情況下進行酸性磷酸酶的活性檢測，檢測得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。該試劑盒可用于檢測細胞或組織的裂解液或勻漿液、血漿、血清、尿液等樣品中內(nèi)源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。組成：編號名稱TE004560TStorage試劑(A):ACPAssaybuffer50ml4℃試劑(B):pNPP2支-20℃避光試劑(C)
4、:TartrateSolution2ml4℃試劑(D):p-nitrophenol(10mM)0.2ml-20℃避光試劑(E):StoppingSolution80mlRT使用說明書1份自備材料：1、比色杯2、水浴鍋或恒溫箱3、分光光度計操作步驟(僅供參考)：1、配制檢測工作液：①配制顯色工作液：取出1支pNPP，恢復至室溫后溶解于ACPAssaybuffer，混勻，冰上預冷備用。新配制的顯色工作液應及時用完。②配制標準品工作液：取出p-nitrophenol(10mM)恢復至室溫后，取溶解于μlACPAssaybuffer，使?jié)舛冗_到一定程度。2、準備
5、樣品：①血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，尿液通常也可以直接用于測定，凍存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的檢測。②細胞或組織樣品：取恰當細胞或組織裂解液，如果有必要可用PBS或生理鹽水進行適當勻漿，一般細胞數(shù)量在106以上，組織應在100mg以上，離心取上清，凍存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的檢測。③植物樣品：取適量的植物組織加入少量生理鹽水或PBS，充分搗碎或研磨，靜置，用紗布或濾紙過濾，離心，留取上清液并測量體積，凍存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的檢測。④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的抗酒石酸酸性磷酸酶，可以使用A
6、CPAssaybuffe、PBS或生理鹽水稀釋后再行檢測。3、加樣：按照下表設置空白對照、標準品、待測樣品，溶液應按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。標準品的用量分別為0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3ml，待測樣品直接加0.3ml。如果樣品中的酸性磷酸酯酶活性過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定。樣品的檢測最好能設置平行管?？瞻讓φ展軜藴势饭艽郎y樣品管ACPAssaybuffer0.3ml(0.3-x)ml(0.3-y)ml顯色工作液0.3ml0.3ml0.3mlTartrateSolution30μl30μl30μl待
7、測樣品——yml標準品工作液—xml—4、輕輕混勻，孵育。5、每孔加入StoppingSolution終止反應。6、酶標儀檢測處吸光值，如果無法檢測，亦可檢測范圍內(nèi)吸光值，一般應數(shù)小時內(nèi)檢測完畢。計算：酸性磷酸酶活性單位的定義：pH4.837℃條件下，每分鐘水解para-nitrophenylphosphate顯色底物產(chǎn)生1微摩爾p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定義為一個酶活力單位。根據(jù)酶活性定義，計算出樣品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。注意事項：1、待測樣品中不能含有磷酸酶抑制劑，同時需避免反復凍融。2、建議每次測定時都做標準曲線，以使標準
8、更準確，另外標準品需避免反復凍融。3、如果沒有酶標儀，也可以使用普通的分光光度計
