枇杷dxr基因克隆和其在果實成熟過程中表達研究

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1、枇杷DXR基因克隆和其在果實成熟過程中表達研究　　摘要：【目的】為了解枇杷（EriobotryajaponicaLindl.）1-脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）還原異構(gòu)酶基因（DXR）的序列特點及其在果實成熟過程的表達特性，【方法】以不同類型枇杷品種‘早鐘6號’（紅肉）和‘白玉’（白肉）不同成熟階段的果肉和果皮為試材，采用RT-PCR結(jié)合RACE法和qRT-PCR方法對DXR基因進行了克隆，并對其在枇杷果實成熟過程中的表達進行了分析，【結(jié)果】枇杷DXR基因的cDNA序列全長1743bp，編碼473個氨基酸，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（Mw）

2、為51299.8Da，等電點（pI）為6.52（GenBank登錄號：JX089590）。qRT-PCR分析表明，在枇杷果實成熟過程中，DXR在不同類型枇杷的不同時期表達不盡相同：在果皮中，‘早鐘6號’品種的DXR基因在果實成熟的各個階段的表現(xiàn)為表達量較為穩(wěn)定，而在‘白玉’品種中，DXR基因的表達存在較為明顯的先增加后降低的過程，其表達量在褪綠期達到最高。而在果肉中，無論是‘早鐘6號’還是‘白玉’品種，DXR基因的表達從果實成熟過程中的未轉(zhuǎn)色期到黃熟期表現(xiàn)為持續(xù)下降；到成熟期時，‘早鐘6號’品種的DXR基因存在明顯的上調(diào)現(xiàn)象，而在‘

3、白玉’9品種中則無此明顯變化，【結(jié)論】DXR基因?qū)τ阼凌祟惡}卜素的合成沒有限制作用，至少作用不明顯。關(guān)鍵詞：枇杷；果實；DXR；基因克隆；實時熒光定量PCR中圖分類號：S667.3文獻標志碼：A文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0563-04在植物體內(nèi)，異戊基焦磷酸（IPP）是類胡蘿卜素合成途徑中第一個較為直接的前體物質(zhì)，而類胡蘿卜素的生物合成所需的IPP絕大多數(shù)都來自質(zhì)體2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑[1]。1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（DXR）基因能催化1-脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP

4、）先異構(gòu)后還原轉(zhuǎn)化成MEP；DXP除了用于合成萜類物質(zhì)之外，還可以用于非萜類物質(zhì)維生素B1和維生素B6的合成，但DXP一旦經(jīng)DXR轉(zhuǎn)化形成的MEP只能再轉(zhuǎn)化成萜類物質(zhì)，因此，DXR活性的高低決定了DXP用于萜類物質(zhì)合成的比例，從而對類胡蘿卜素的合成起到十分重要的作用。DXR基因首先在擬南芥中報道[2]，隨后Carretero-Paulet等[3]研究指出：DXR基因由單基因編碼，可在多種組織中廣泛表達。近年來，在長春花[4]、玉米[5]、金魚草[6]、銀杏[7]、橡膠[8]等多種植物中先后克隆出了該基因。枇杷果實的主要色素是類胡蘿卜

5、素，其含量與組成賦予果實不同的顏色。我們通過對枇杷的DXR基因的克隆、序列分析，并結(jié)合實時熒光定量PCR9技術(shù)對不同類型枇杷果實成熟過程中果肉和果皮DXR表達量進行檢測，初步明確DXR的表達規(guī)律，從而為研究枇杷類胡蘿卜素的積累與DXR基因的表達之間的關(guān)系提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料1.2方法1.2.1枇杷總RNA的提取及DXR基因cDNA全長的獲得枇杷總RNA的提取參照張玲等[9]的方法。以‘早鐘6號’總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行PCR擴增。其中DXR基因保守片段的擴增引物參考金蓉[10]設(shè)計的引物。在獲得DXR基因的保守片段

6、之后，分別采用3’RACE方法擴增3’末端序列，5’RACE采用同聚物加尾的方法進行。用天根公司的DNA回收純化試劑盒對目的片段進行回收純化，并與pMD19-T載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，進行藍白斑篩選。所有測序均由上海美吉生物有限公司完成。將所得保守片段、3’和5’片段序列進行拼接，重新設(shè)計特異引物，以‘早鐘6號’總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴增DXR基因cDNA全長。表1示DXR基因克隆所用引物。1.2.2基因生物信息學(xué)分析利用生物信息學(xué)軟件BLAST比對分析，找出起始密碼子、完整的開放閱讀框、終止密碼子、5

7、’非編碼區(qū)、3’9非編碼區(qū)和poly（A）尾巴；并通過DNAMAN軟件，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，預(yù)測分析蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)，同時進行多重序列比對。2結(jié)果與分析2.1枇杷DXR基因的克隆和分析將枇杷DXR基因全長及其推導(dǎo)蛋白質(zhì)與GenBank中的序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上，與玫瑰（AEZ53171.1）、毛果楊（XP_002318048.1）、橡膠樹（ABD92702.1）、蓖麻（XP_002511399.1）、葡萄（XP_002282761.1）、番茄（NP_001234553.1）、煙草（ABH08964.1）、

8、金魚草（AAW28998.1）、擬南芥（XP_002866510.1）等植物的氨基酸序列同源性都大于83%。其中與玫瑰（AEZ53171.1）DXR同源性最高，為92%。2.2DXR基因在枇杷果實不同階段的轉(zhuǎn)錄水平分析3討論在轉(zhuǎn)DXR