裂解液作用資料.doc

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1、精品好文檔，推薦學(xué)習(xí)交流1、核酸抽提原理簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑（如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等）和鹽（如Tris、EDTA、NaCl等）。鹽的作用，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境（如Tris），還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞（如EDTA）、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定（如NaCl）等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從

2、而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑（如GIT、GuHCl等）裂解的，該方法已經(jīng)成為了RNA抽提的主流，卻不是基因組DNA抽提的主流。最常用的純化方法，一是PC抽提+醇沉淀，二是介質(zhì)純化。第一種方法是利用PC對裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項(xiàng)介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點(diǎn)，實(shí)

3、現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個(gè)變體，省略了PC操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的PCR。其它雜質(zhì)–如多糖、多酚等-的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實(shí)現(xiàn)的。2、了解你的實(shí)驗(yàn)樣品如果你研究某個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時(shí)，抽提核酸的實(shí)驗(yàn)就會(huì)碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血

4、一樣的起始量去抽提鳥血的基因組DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時(shí)，只有對實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結(jié)果。對一些雜質(zhì)含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組DNA是碰到雜質(zhì)殘留過大的問題，可以試一下-20C保存一天后再抽提的對策，可能會(huì)有意想不到的效果。樣品如果因?yàn)槟承┰虮仨毾刃斜４妫惨群喕幌聵悠罚貉鹤詈弥槐４嬗泻思?xì)胞；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融。如果實(shí)驗(yàn)室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。3、裂解方法的評價(jià)含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因

5、組DNA的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用；同時(shí)，巨大的基因組DNA是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組DNA“纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組DNA的純度更高。另外一個(gè)思路是，如果基因組DNA與蛋白質(zhì)“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組DNA的特性占優(yōu)勢，則純化時(shí)以DNA的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時(shí)以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致DNA的損失。有些樣品，

6、如肌肉，即使是RNA抽提，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液（或者在操作中的某個(gè)時(shí)候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì)），原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細(xì)胞基因組DNA抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡?，而?jīng)濟(jì)性及操作簡單很重要時(shí)?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會(huì)比用PC抽提的差一些。高濃度蛋白質(zhì)變性劑（如GIT、GuHCl等）的裂解方法，是抽提RNA的首選?？俁NA的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞

7、膜，至于與基因組DNA相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫?huì)對以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的RNA酶，從而確保了RNA的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品–主要是植物，其它絕大部分樣品的RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。該方法也可用于基因組DNA抽提，非?？焖俸唵?，但純度不是很高。含CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組DNA抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個(gè)因素有關(guān)：一是CTAB的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB僅供

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