植物氨態(tài)氮測定.doc

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1、植物組織氨基酸含量的測定（改良的茚三酮比色法）一、實驗原理植物吸收的氮主要是氨態(tài)氮和硝態(tài)氮，后者經(jīng)過還原過程形成氨，前者經(jīng)同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白質(zhì)。測定氨態(tài)氮的方法有多種，本實驗為改良的茚三酮比色法。α-氨基酸與水合茚三酮溶液一起加熱，經(jīng)氧化脫氨變成相應(yīng)的α-酮酸，酮酸進一步脫羧變成醛，水合茚三酮則被還原，在弱酸環(huán)境中，還原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反應(yīng)，縮合生成藍紫色物質(zhì)。根據(jù)藍紫色的深淺，在580nm波長下測定吸光值。本實驗中在茚三酮試劑中添加乙二醇并補加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不穩(wěn)定性。二、儀器設(shè)備研缽、燒杯、漏斗、量筒、具塞試管、三角瓶、

2、容量瓶、移液管、天平、沸水浴鍋、可見分光光度計三、試劑1.10%醋酸(100mL)2.1%抗壞血酸（100mL）3.5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至1000mL）4.pH5.4醋酸緩沖液：8.8mL0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55mL稀釋至1000mL）加41.2mL0.2mol/L醋酸鈉（醋酸鈉16.4g或三水醋酸鈉27.2g配成1000mL）。5.水合茚三酮試劑：1.1g茚三酮放到燒杯中，加入15mL正丙醇，搖勻，溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混勻，再加9mLpH5.4醋酸緩沖液，混勻。保存于棕色瓶中，冰箱保存，適用期限10天。四、操作步驟1.標

3、準曲線的繪制以下表所示量從5μg/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分別取溶液并在每個試管中加蒸餾水至2mL，對照僅加2mL蒸餾水，后在各試管中加入3mL水合茚三酮試劑和0.1mL1%抗壞血酸，搖勻。蓋上試管塞，于沸水中加熱15分鐘，取出后攪拌冷卻15分鐘。冷卻后的有色溶液中加無水乙醇至10mL，在波長580nm處測吸光值，以氨態(tài)氮濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。試管號1234567試劑（mL）00.20.40.81.21.61.8氨態(tài)氮濃度00.512345（μg/mL）2.稱取0.5g新鮮植物材料，放入研缽中，加入5mL10%醋酸，研磨后以蒸餾水稀釋至100mL，混勻，

4、通過濾紙過濾，棄去最先濾下的一部分濾液后過濾到100mL三角瓶中。3.從剩下的濾液中取2mL放入試管中，加3mL水合茚三酮試劑和0.1mL1%抗壞血酸，搖勻。蓋上試管塞，于沸水中加熱15分鐘。同時將盛有對照溶液（提取液用蒸餾水代替）的試管加熱。2.取出后攪拌冷卻15分鐘。加熱形成的紅色茚三酮試劑被氧氧化而褪色，茚三酮與氨基酸形成的藍紫色反應(yīng)產(chǎn)物仍然存留并變得更加鮮明。冷卻后的有色溶液中加無水乙醇至10mL，混勻。在波長580nm處測光密度值，根據(jù)標準曲線查得數(shù)值代入以下公式計算氨態(tài)氮含量。（10-6×100×C）X（100g樣品中的氨態(tài)氮毫克數(shù)）=×100nC：比色液中氨態(tài)氮濃度（μg/

5、mL）n：樣品重量（g）100：分析溶液總體積（mL）5.實驗結(jié)果與分析氨態(tài)氮含量標曲：序號1234567氨態(tài)氮濃度00.512345OD值0.1520.2370.3180.4150.4840.6070.718方程：y=0.1073X+0.181測定樣品液的OD580值為：0.939標曲查得：0.939=0.1073C-0.181C=10.38μg/mL（0.1×10×10.38μg/mL）X（100g樣品中的氨態(tài)氮毫克數(shù)）=×100=10.38mg/100g（2×0.5）故：該植物中氨態(tài)氮的含量為10.38mg/100g。