外周血的NK細(xì)胞分離培養(yǎng).docx

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1、???????????????????????料推薦???????????????????外周血的NK細(xì)胞分離培養(yǎng)1.樣本采集常規(guī)操作采集患者外周血，避免樣本污染。2.細(xì)胞分離超凈工作臺(tái)中，分裝血樣于50mL離心管中，取全血樣1mL計(jì)數(shù)（3mL全血留樣）。2000rpm離心10min，取上層血漿于50mL離心管（1.5mL未滅活血漿留樣）。56℃滅活30min，3000rpm離心10min，去沉淀后4℃保存上清。生理鹽水1:1稀釋混勻血細(xì)胞，緩慢加到裝有Ficill的離心管內(nèi)（界面清晰，血樣：Ficoll不超過2:1），1600rpm離心20min

2、。吸棄上清，吸取白膜層到離心管，加生理鹽水至45mL，混勻后1500rpm離心10min。吸棄上清，生理鹽水重懸后合并一管，加生理鹽水至45mL。混勻，取樣計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞總量，1800rpm離心10min。參照試劑盒說明書配置培養(yǎng)液、滋養(yǎng)細(xì)胞液。3.細(xì)胞培養(yǎng)（山東齊魯細(xì)胞治療NK細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒）0d，T75培養(yǎng)瓶接種：30mL細(xì)胞懸液+NK-1試劑[2]+5%自體血漿，37℃，5.0%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（接種密度1.0-1.5*106/mL）3d，離心換液：T75培養(yǎng)瓶中細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml離心管1600rpm/min升6降4離心10min去除上清。細(xì)

3、胞沉淀+NK細(xì)胞培養(yǎng)液（30mL）+5%自體血漿于新T75培養(yǎng)瓶。5d，轉(zhuǎn)移到T175培養(yǎng)瓶，細(xì)胞狀態(tài)好，加培養(yǎng)液到50mL（5%自體血漿）。6d，觀察細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)好，加培養(yǎng)液到120mL（5%自體血漿）。7d，觀察細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)，裝袋并添加1支NK-2試劑[2]，加培養(yǎng)液到220mL（1%自體血漿），菌檢。8d，加培養(yǎng)液到500mL（1%自體血漿）。9d，加培養(yǎng)液到1000mL（1%自體血漿）。10d，加培養(yǎng)液到1400mL（1%自體血漿）。11d，加培養(yǎng)液到1600mL（1%自體血漿）。12d，加培養(yǎng)液到1800mL（1%自體血漿）。13/15d，

4、根據(jù)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)及臨床安排收獲細(xì)胞。計(jì)數(shù)計(jì)活及流式檢測(cè)。[1]:NK細(xì)胞培養(yǎng)液：1支D試劑、1支E試劑溶解到1瓶C試劑中。[2]:NK-1、NK-2試劑為滋養(yǎng)細(xì)胞，須嚴(yán)格按照常規(guī)細(xì)胞的保存及復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)操作，使用前需離心去除上清才能共培養(yǎng)。1???????????????????????料推薦???????????????????預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：第8天第9天第10天第11天第12天第13天第14天第15天計(jì)數(shù)結(jié)果0.80.50.30.20.1（109/mL）計(jì)活結(jié)果100100100100100(%)2