過表達RIP3增強乳腺癌細胞對小白菊內(nèi)酯的敏感性的作用機制研究.docx

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1、過表達RIP3增強乳腺癌細胞對小白菊內(nèi)酯的敏感性的作用機制研究目的：構(gòu)建含有RIP3基因的真核表達載體,研究過表達RIP3基因?qū)π“拙諆?nèi)酯抗乳腺癌細胞作用的影響及機制。為其作為抗乳腺癌新藥的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測及比較4株人乳腺癌細胞系MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,T47D及正常人乳腺上皮細胞MCF10A中RIP3mRNA的表達水平。以正常人乳腺上皮細胞MCF10A反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,PCR擴增RIP3基因cDNA全長,將合成的RIP3基因克隆入mCherry載體

2、的N末端,構(gòu)建重組質(zhì)粒mCherry-RIP3,測序證實mCherry-RIP3重組質(zhì)粒構(gòu)建正確與否。通過慢病毒法構(gòu)建穩(wěn)定過表達RIP3的MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細胞株。熒光顯微鏡下觀察mCherry-RIP3蛋白在MCF-7及MDA-MB-231細胞內(nèi)的表達效率及定位。RT-PCR及WesternBlot檢測目的基因RIP3在MCF-7及MDA-MB-231細胞內(nèi)mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平。用不同濃度小白菊內(nèi)酯分別處理過表達RIP3及表達空載體乳腺癌細胞,顯微鏡下觀察不同處理組乳腺癌細胞形態(tài)的變化,熒光顯微鏡下

3、觀察不同處理組乳腺癌細胞核形態(tài)的改變,MTT比色法檢測不同處理組乳腺癌細胞增殖的變化及量效關(guān)系,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡及細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平,WesternBlot檢測PARP蛋白及其裂解片段表達水平,小白菊內(nèi)酯處理細胞的同時加用抗氧化劑NAC(N-乙酰半胱氨酸,N-acetyl-L-cysteine),MTT法檢測乳腺癌細胞增殖的變化。結(jié)果：1.RT-PCR檢測到MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,T47D細胞中RIP3基因普遍低表達,但在正常乳腺癌細胞MCF10A中高表達。2.重組載體測序鑒定該序列與Ge

4、nBank中的序列相同。獲得外源性RIP3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231細胞株,熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光蛋白表達率達90%以上,并且定位于胞質(zhì)。RT-PCR及WesternBlot檢測到目的基因RIP3在轉(zhuǎn)染細胞中為過表達。3.隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加,MCF-7及MBA-MB-231細胞逐漸縮小變圓,細胞膜邊界不清、胞膜破裂、細胞溶解死亡,與表達空載體MCF-7及MBA-MB-231細胞相比過表達RIP3細胞出現(xiàn)上述形態(tài)變化較明顯。另外,過表達MCF-7及MBA-MB-231細胞相比表達空載體乳腺癌細胞表現(xiàn)出更多

5、的核固縮及碎裂。4.MCF-7及MDA-MB-231細胞的增殖率隨小白菊內(nèi)酯藥物濃度的增高而降低。其中,過表達RIP3的MCF-7及MBA-MB-231細胞在相同濃度小白菊內(nèi)酯的處理下增殖率較表達空載體乳腺癌細胞低(P<0.05)。5.同等濃度小白菊內(nèi)酯處理下,過表達RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231細胞凋亡率明顯高于相應(yīng)的表達空載體細胞組(P<0.05)。6.同等濃度小白菊內(nèi)酯處理下,過表達RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231細胞內(nèi)PARP蛋白裂解片段的表達高于相應(yīng)的表達空載體細胞組。7.剛等濃度小

6、白菊內(nèi)酯處理下,過表達RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231細胞內(nèi)ROS水平明顯高于表達空載體細胞組(P<0.05)。聯(lián)用抗氧化劑NAC后,各組乳腺癌細胞對小白菊內(nèi)酯的敏感性下降,且過表達RIP3基因的MCF-7及MBA-MB-231細胞與表達空載體細胞增殖率相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：1.RIP3基因在乳腺癌細胞MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,T47D中普遍低表達,而在正常乳腺細胞MCF10A中表達水平較高。本實驗成功構(gòu)建RIP3基因過表達重組質(zhì)粒,獲得穩(wěn)定過表達外源性RIP3的乳腺癌MC

7、F-7及MDA-MB-231細胞株。2.小白菊內(nèi)酯對于乳腺癌細胞的殺傷呈濃度依賴性,過表達RIP3基因可增強小白菊內(nèi)酯對MCF-7及MDA-MB-231細胞的DNA損傷、生長抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。3.過表達RIP3基因增強小白菊內(nèi)酯對MCF-7及MDA-MB-231細胞殺傷作用的機制可能與其促使細胞內(nèi)ROS的積聚有關(guān)。