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《豬腺病毒3型PCR檢測(cè)方法的建立及Hexon基因克隆分析.docx》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、豬腺病毒3型PCR檢測(cè)方法的建立及Hexon基因克隆分析豬腺病毒3型(Porcineadenovirus3,PADV-3)是豬腺病毒中最常見的一種血清型,主要引起豬群腹瀉。1964年Haig首次從英格蘭腹瀉仔豬直腸拭子中分離到該病毒,隨后在澳大利亞、美國(guó)、加拿大、西班牙、中國(guó)等國(guó)家相繼被報(bào)道。目前,由于對(duì)PADV-3研究較少,在該病毒結(jié)構(gòu)和功能、診斷方法、流行病學(xué)、致病性等方面均有待深入系統(tǒng)研究。本研究根據(jù)GeenBank中登陸的PADV-3E1B基因序列(登錄號(hào):AB026117),利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小分別為247bp和194bp。經(jīng)條件優(yōu)化,成
2、功建立了針對(duì)PADV-3PCR檢測(cè)方法和熒光定量PCR檢測(cè)方法,兩種方法的特異性和重復(fù)性較好,且均具有較高靈敏度,分別最低可檢3.7×10~5拷貝/μL和3.1×10~2拷貝/μL。應(yīng)用本研究建立的常規(guī)PCR開展PADV-3感染情況調(diào)查,對(duì)從四川省部分地區(qū)收集的283份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,PADV-3總陽(yáng)性率為7.07%(20/283),非腹瀉豬群PADV-3陽(yáng)性率為3.31%,腹瀉豬群中PADV-3陽(yáng)性率為9.87%,顯著高于非腹瀉豬群。應(yīng)用所建實(shí)時(shí)熒光定量PCR開展PADV-3感染組織特性研究,對(duì)8頭PADV-3感染陽(yáng)性仔豬相應(yīng)組織器官進(jìn)行采樣檢測(cè)。結(jié)果顯示,腸粘膜、腸系膜淋巴
3、結(jié)、肺、扁桃體中PADV-3含量分別為2.24×10~4~6.42×10~5拷貝/mg、9.49×10~3-7.36×10~4拷貝/mg、5.59×10~3~1.65×10~5拷貝/mg和9.93×10~3~1.89×10~5拷貝/mg,病毒含量顯著高于其它組織器官。根據(jù)GenBank中PADV-3Hexon基因序列(登錄號(hào):AC000189)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。以陽(yáng)性病料DNA為模板,分段擴(kuò)增克隆,經(jīng)測(cè)序分析,得到Hexon全基因序列(登錄號(hào):KU761583)。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)所獲PADV-3Hexon全基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,所獲Hexon全基因?yàn)?799bp,編碼932個(gè)氨基酸,理論
4、分子質(zhì)量為10~5653.8u,理論等電點(diǎn)為5.23;該蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.92,屬不穩(wěn)定蛋白;且同一氨基酸的不同密碼子的選擇上存在一定的偏向性。該蛋白最大疏水指數(shù)和最小疏水指數(shù)分別為2.289和-3.011,表現(xiàn)一定疏水性;氨基酸中無(wú)信號(hào)肽切割位點(diǎn),推測(cè)該蛋白缺乏信號(hào)肽。Hexon蛋白含有25個(gè)絲氨酸、18個(gè)蘇氨酸、21個(gè)絡(luò)氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和35個(gè)抗原位點(diǎn)。將PADV-3克隆株(SCMS01株)與參考株的Hexon基因核昔酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示,核苷酸同源性為87.8%-10~0%,表明PADV-3在各國(guó)之間流行不穩(wěn)定。對(duì)SCMSOl株和參考株Hexon基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)
5、果顯示,SCMSOl株與德國(guó)株(PGOU244)在一個(gè)小分支上,兩者親緣性較高。