單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)復(fù)蘇與培養(yǎng)、消化與凍存.docx

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1、單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）復(fù)蘇與培養(yǎng)、消化與凍存1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1細(xì)胞及中藥單體成分：小鼠RAW264.7單核巨噬細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；LPS購(gòu)于sigma公司；1.1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)液：Gbico公司產(chǎn)品胎牛血清：Gbico公司產(chǎn)品DMSO(批號(hào)DZ0231)：AMRESCO公司產(chǎn)品胰蛋白酶：Merck公司產(chǎn)品青霉素-鏈霉素：Gbico公司MTT、臺(tái)盼藍(lán)試劑：Sigma公司產(chǎn)品PBS：上海雙螺旋生物科技有限公司TNF-αELISA試劑盒：美國(guó)eBioscience公司1.1.3儀器CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)ThermoFroma公司酶標(biāo)儀：Biora

2、d公司倒置顯微鏡：日本olympus公司高速低溫冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司側(cè)擺搖床：歐瑞實(shí)驗(yàn)器材公司培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿、24孔/48孔/96孔培養(yǎng)板、離心管：美國(guó)BD公司1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）復(fù)蘇與培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)操作前，先將水浴鍋預(yù)先調(diào)至37℃，無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱，15ml的離心管4℃熱平衡；用鑷子將單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出，浸入含37℃水的燒杯內(nèi)，輕輕晃動(dòng)凍存管，凍存管內(nèi)冰核差不多融化時(shí)取出凍存管移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，用酒精棉球擦拭管口；在15ml離心管內(nèi)加入4ml含10%FBS及1

3、%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，再將凍存管內(nèi)含細(xì)胞的懸液吸至該離心管內(nèi)，蓋上管蓋，輕輕搖勻和上下顛倒混勻；繼續(xù)添加含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液至離心管刻度14ml處，蓋上管蓋，輕輕顛倒混勻；離心機(jī)設(shè)置4℃，1000rpm，離心5min后，小心吸出上清液，然后輕彈離心管底部使細(xì)胞團(tuán)分散，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液14ml，蓋上管蓋，輕輕顛倒混勻，4℃，1000rpm離心5min，棄上清液，加2ml無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，取50μl細(xì)胞懸液使用臺(tái)盼藍(lán)試劑進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)；加細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需

4、的細(xì)胞濃度，移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)內(nèi)置于含5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）中，1-2d更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，呈貼壁生長(zhǎng)，2-3d用0.25%胰酶消化傳代1次。1.2.2單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）消化與凍存單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）消化:實(shí)驗(yàn)操作前，先將水浴箱預(yù)先調(diào)至37℃，將0.25%胰酶及含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液置于37℃水浴箱中水浴備用，將長(zhǎng)滿單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的培養(yǎng)瓶中原培養(yǎng)液棄去，用PBS洗滌3次，再加入1-2ml0.25%胰酶，使瓶底細(xì)胞都浸入胰酶溶液中，于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中消化3min；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，原貼

5、壁細(xì)胞逐漸趨于圓形時(shí)，加入10ml含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化；輕輕敲打培養(yǎng)瓶并用吸管將貼壁細(xì)胞吹打成懸液，分別轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，蓋上管蓋，輕輕顛倒混勻，4℃，1000rpm離心5min，棄上清液，加4ml含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液混勻，取50μl細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再加適應(yīng)量的含10%FBS及1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞密度為1x106個(gè)/ml；再移至培養(yǎng)瓶或24孔板內(nèi)培養(yǎng)內(nèi)置于培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中培養(yǎng)。單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）凍存：將備好的細(xì)胞凍存管做好

6、標(biāo)記（RAW264.7、日期、實(shí)驗(yàn)室單位），配置好一定量的細(xì)胞凍存液，配置比例為RPMI-1640培養(yǎng)液：血清：DMSO=7：2：1；將已經(jīng)消化下來的細(xì)胞懸液4℃，1000rpm離心5min，棄上清液，留下細(xì)胞，緩慢加入已經(jīng)配好的細(xì)胞凍存液，輕輕混勻；每個(gè)細(xì)胞凍存管中加入含凍存液的細(xì)胞懸液1.8ml，蓋上瓶蓋，置于梯度降溫盒內(nèi)，再分別放在4℃冰箱內(nèi)30min、-20℃冰箱內(nèi)2h和-80℃冰箱內(nèi)過夜；第二天放于液氮罐內(nèi)并且做好標(biāo)記和登記工作（存放單位、存放時(shí)間、存放管數(shù)）。