乙肝病毒cccDNA檢測

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乙型肝炎病毒cccDNA——檢測方法與應(yīng)用價值 一、幾個相關(guān)問題簡介 什么是HBVcccDNA?即共價閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主細胞后在細胞內(nèi)復(fù)制并建立感染狀態(tài)，病毒松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）進入細胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓撲酶等“修復(fù)”形成的、結(jié)構(gòu)完整的、超螺旋雙鏈DNA分子。 乙型肝炎病毒基因組結(jié)構(gòu)示意圖 乙型肝炎病毒的復(fù)制過程 我們?yōu)槭裁匆P(guān)注HBVcccDNA??cccDNA存在于細胞核內(nèi)，成為乙肝病毒的復(fù)制“池”?目前尚沒有可以進入細胞核內(nèi)，并能夠清除cccDNA的藥物，這也是現(xiàn)有抗病毒藥物治療效果不佳和治療后容易復(fù)發(fā)的原因之一?肝臟以外器官組織細胞可能存在cccDNA，成為肝臟移植術(shù)后乙肝復(fù)發(fā)的來源?還沒有穩(wěn)定、可靠、敏感的cccDNA檢測試劑盒問世 為什么沒有cccDNA檢測試劑盒問世?·研究和開發(fā)該檢測技術(shù)的時間不長·檢測技術(shù)上的難度較大·前期研究主要集中于細胞模型和動物肝臟模，不能滿足臨床檢驗的需求·現(xiàn)有技術(shù)靈敏度不高，檢測低限104copy/ml左右·分研究機構(gòu)和學(xué)者對檢測技術(shù)的特異性認識不足，存在缺陷 ·多種同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBVDNA），必須有效地分離cccDNA和其他類型的病毒DNA·如何進一步解決特異性的問題？·如何解決靈敏度不高的問題（細胞內(nèi)cccDNA含量的較低），血清中含量？·如何簡化檢測步驟？建立cccDNA檢測技術(shù)必須克服的難點 cccDNArcDNA核酸一級結(jié)構(gòu)完整的雙鏈兩條鏈均不完整核酸空間結(jié)構(gòu)閉合環(huán)狀，超螺旋松弛環(huán)狀，非超螺旋是否與蛋白質(zhì)結(jié)合不結(jié)合共價結(jié)合對某些核酸酶抗性強，不容易被降解弱，容易被降解分離cccDNA和rcDNA的分子基礎(chǔ)分離cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差異 二、HBVcccDNA檢測技術(shù) 1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介 現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介?選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法 設(shè)計一對特殊引物：跨雙缺口引物正義引物P1：與負鏈互補結(jié)合，位于正鏈缺口上游反義引物P2：與正鏈互補結(jié)合，位于負鏈缺口下游目的：rcDNA不被擴增1.選擇性PCR 選擇性PCR：rcDNA不被擴增 選擇性PCR：cccDNA能被擴增 PCR產(chǎn)物自身退火（selfannealing）“選擇性”PCR：并非萬無一失 rcDNA被大量擴增，陽性結(jié)果不可靠，定量結(jié)果也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)Kock等：反應(yīng)管中rcDNA含量不能超過105copyHepatology1996;23:405-413血清HBVrcDNA超過108copy/ml，進行熒光PCR可能會出現(xiàn)檢測結(jié)果假陽性“選擇性”PCR：并非萬無一失 與定性法比較增加了一個熒光探針，探針位于擴增片段區(qū)（負鏈缺口下游），與cccDNA的負鏈互補。選擇性實時熒光定量PCR檢測cccDNA rcDNA不能被擴增無熒光信號EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被擴增檢測到熒光信號選擇性實時熒光定量PCR檢測cccDNA 實時熒光定量PCR的原理 實時熒光定量PCR的原理 實時熒光定量PCR的原理 標準曲線方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy相關(guān)指數(shù)：R2=0.995靈敏度至少可以達到103copy/ml結(jié)果：選擇性實時熒光定量PCR檢測cccDNA ·同樣存在PCR產(chǎn)物自身退火引起的rcDNA非特異性擴增的問題·由于靈敏度較普通PCR高，假陽性率比普通PCR更高缺陷：選擇性實時熒光定量PCR檢測cccDNA 質(zhì)粒標準品107copy/ml3.5×108copy/ml攜帶者血清質(zhì)粒標準品105copy/ml105~107copy/ml攜帶者血清選擇性實時熒光定量PCR檢測cccDNA 解決方案特異性抽提分離cccDNA與其它形式的病毒DNA采用沉淀法或質(zhì)粒抽提試劑盒抽提法酶切純化cccDNA采用綠豆核酸酶或ATP依賴的plasmid-safeDNA酶選擇性實時熒光定量PCR檢測cccDNA 1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)?侵入者探針法（Invaderassaay）3.嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介 2.侵入者探針法(Invaderassay)兩個體系：兩種特殊的探針：invaderprobe和primaryprobe，后者含與待測模板無關(guān)的5’側(cè)翼的堿基片段。熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)：被核酸內(nèi)切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特異地切割5’側(cè)翼堿基片段作為第二個invader，與熒光共振能量轉(zhuǎn)移盒（FRETC）結(jié)合，裂解酶切割FRETC上含有熒光基團的短臂，發(fā)出熒光信號。特點：一個模板可以重復(fù)使用，每“結(jié)合—裂解—結(jié)合—裂解”一次為一個循環(huán)，每循環(huán)一次產(chǎn)生一個熒光信號，呈線性信號放大 侵入者探針法定量檢測cccDNA的優(yōu)缺點優(yōu)點：線性信號放大，特異性比熒光PCR法強缺點：靈敏度低：104copy/ml 1.選擇性PCR(普通PCR、套式PCR、熒光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）?嵌合引物熒光PCR法現(xiàn)有的幾種cccDNA檢測技術(shù)簡介 3.嵌合引物熒光PCR法Shao,etal.JVirolMethods2003；112：45-52+PNN：與HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNA PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物熒光PCR法 嵌合引物熒光PCR的優(yōu)缺點優(yōu)點：克服了熒光PCR法的部分缺陷，靈敏度比侵入法提高缺點：仍不能完全避免待測標本中存在的rcDNA被非特異性擴增 無論是選擇性熒光PCR，還是侵入者探針法或嵌合引物熒光PCR，本身都不能解決在高rcDNA背景條件下的假陽性問題，必須結(jié)合抽提分離、酶切純化等步驟，以提高特異性。 三、影響cccDNA池的因素 1.cccDNA池的自身恒定?cccDNA池：感染肝細胞核內(nèi)HBVcccDNA的含量在無外來干擾的情況下保持恒定(5－50copy/cell)?病毒自身調(diào)節(jié)：關(guān)于病毒的進化關(guān)于病毒的“思維”病毒自身的調(diào)節(jié)?外來壓力：打破病毒含量自身恒定的結(jié)果 2.抗病毒藥物對cccDNA的影響現(xiàn)有抗病毒藥物，包括干擾素和各種核苷類似物，可以一過性地減少cccDNA，但均不能清除cccDNA細胞核內(nèi)cccDNA含量的相對穩(wěn)定性，決定了長療程抗病毒治療的必要性 3.肝外組織也是cccDNA的儲存池？·肝外組織細胞中HBV標志的存在情況：腎、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃腸黏膜、皮膚、睪丸、前列腺、唾液腺等組織或細胞中均檢測到HBV的標志物·HBV吸附？暫居？建立感染狀態(tài)？依據(jù)：從上述組織細胞中檢測到cccDNA，但必須解決檢測技術(shù)問題 (2)關(guān)于血清中是否存在cccDNA的問題·“血清中rcDNA含量越高，cccDNA陽性率越高和含量越高”的現(xiàn)象，使我們對方法學(xué)提出質(zhì)疑·肝衰竭的病人在一定病期有可能大量釋放cccDNA入血·細胞壞死后，cccDNA釋放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少時間？ Thankyou