分子生物學(xué)課件chap2-3_2010

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2.3.9.三股螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA)潛在的專一與DNA(蛋白質(zhì))結(jié)合的能力※T.SDNA的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)l1953年以前Pauling(Chemist)提出T.SDNA存在的可能性l1953年Watson&CrickD.SDNAmodel證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體形成T.SDNA可能性DNA結(jié)構(gòu)領(lǐng)域與Watson競(jìng)爭(zhēng)，支流?主流? l1957年Davis,Felsenfeld,Rich發(fā)現(xiàn)poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNAT.SDNA的概念l1966年Miller&Sobell實(shí)現(xiàn)RNA+D.SDNATriblepolyNtasRepressor關(guān)閉基因但由于D.SDNA的提出而被忽視但因證明LacI產(chǎn)物為Repressor而被忽視 ●1975年P(guān)erlgut人工合成T.SDNA并證明其Tm值,沉降系數(shù)(S)l1987年Mirkin.S.MNature330(495)證明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在●1987年Dervan.MoserScience238(645)合成S.SDNA+D.SDNA→T.SDNA實(shí)現(xiàn)DNA的定點(diǎn)切割研究X-rayphotograph核磁共振→結(jié)構(gòu)功能 繼Davis（1957）后30年第一次證明T.SDNA在生物體內(nèi)的存在 ※T.S.DNA的類型PolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAPolyT/ATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAA●D.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA+S.S.DNA ●HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNA(mirrorimagestructure)-------TTCCCTCTTTCCC------CCCTTTCTCCCTT-------------AAGGGAGAAAGGG---GGGAAAGAGGGAA----Mirkin(1987)pGG332plasmidDNA--------TTCCCTCTTTCCC----------------AAGGGAGAAAGGG---------------TTCCCTCTTTCCC-----------------AAGGGAGAAAGGG-------NoduleDNAHingedDNAfreeDNA HomologouspalindromicsequenceinaD.S.DNANoduleDNAorHingedDNA三鏈螺旋雙鏈螺旋HingedDNAHingedDNA lS.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA☆PU+PU/PY(偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定)☆PY+PU/PY(偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定)常見類型第三條鏈位于B-DNA的Majorgroove中與D.S.DNA一起旋轉(zhuǎn) T.S.DNA的連接鍵WatsonbondingA＝TG≡C(D.S.DNA)H+Hoogsteenbonding第二鏈的pu6‘,7’與第三鏈的py4‘,3’形成H鍵G＝C+(pH小于7)第三鏈質(zhì)子化G(6,7)＝G(1,2)A＝AG＝A+A＝T? 三股螺旋DNA形成的條件及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)第三條單鏈DNA分子位于B-DNA大溝內(nèi)與B-DNA以Hoogsteen鍵連接在Py/Pu(A,G):Pu(A,G)結(jié)構(gòu)中有多種配對(duì)方式，鏡向結(jié)構(gòu),非必需條件TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed在Py/Pu:Py結(jié)構(gòu)中AT,GC兩氫鍵配對(duì)C質(zhì)子化鏡相結(jié)構(gòu)必需條件 l無論何種形式的三螺旋DNA,第二股中間鏈必須是Purin鏈l第三股鏈至少長(zhǎng)于8dNtl真核生物基因組內(nèi),約1%左右的序列為大于100bp的homologouscluster(重復(fù)序列與調(diào)控序列)T.S.DNA多存在于其中 T.S.DNA可能的功能可阻止調(diào)節(jié)蛋白與DNA結(jié)合,關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄過程micro－RNAEpigenetic!b)與基因重組,交換有關(guān)加入第三條S.S.DNA作為分子剪刀(molecularscissors),定點(diǎn)切割DNA分子d)加入反義的第三條鏈(anti-sencepolydNt)終止基因的表達(dá) 2.3.10.四股螺旋DNA(tetraplexDNA,tetrableHelixDNA，quadruplexDNA)發(fā)現(xiàn)1958.Poly(I)X-rayphotograph堿基形成環(huán)狀氫鍵連接結(jié)構(gòu)TetrableHelixDNA均有形成四股螺旋DNA的可能5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’Poly(G),4(dG)染色體端粒高度重復(fù)的DNA序列著絲點(diǎn)附近的高度重復(fù)序列 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)LinkedbyHoogsteenBonding6－17－27GGGG6767766 2×poly(T4G4)2×poly(G4C4)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) GGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT真核生物染色體端粒DNA結(jié)構(gòu)G-quadruplex5‘3‘TTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTTTTT 可能的功能A穩(wěn)定真核生物染色體結(jié)構(gòu)B保證DNA末端準(zhǔn)確復(fù)制C與DNA分子的組裝有關(guān)D與染色體的meiosis&mitosis有關(guān)HoogsteenBonding5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT3’-----AATCCCAATCCCGGGTA 可能的功能E.G-quadruplex阻止端粒酶對(duì)端粒DNA的延伸（因?yàn)镚-quadruplex不是端粒酶的底物）5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT3’-----AATCCCAATCCCGGGTAG-quadruplex的邊序直接影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性! 2.4.基因概念的多樣性 2.4.1.生物進(jìn)化的C值矛盾(Cvalueparadoxofnucleotide)ThetotalamountofDNAinthegenomeofhaploidIsacharacteristicofeachlivingspeciesknownasitsMaximumCvalue(單倍體基因組總DNA的含量)最大C值(MaximumCvalue)ThetotalamountofDNAforencodingthegenesinformationistermeditsMinimumcvalue（編碼基因信息的總DNA含量）最小C值(Minimumcvalue) Cvalueparadoxofnucleotide霉菌藻類G+細(xì)菌G-細(xì)菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類棘皮類甲殼類昆蟲類軟體動(dòng)物蠕蟲類真菌支原體A生物體進(jìn)化程度高低與大C值不成明顯相關(guān)（非線性）B親緣關(guān)系相近的生物大C值相差較大C一種生物內(nèi)大C值與小c值相差極大（Euk.人體c=C/10）(Prok.Φx174c＞C) 2.4.2.重疊基因(overlappinggene)F.Sanger1977X174dntsequencingC=5387bpc=11×2000bp 2.4.2.1基因重疊方式Mis-readingforstopcodon(Q?RNAvirus1973.A.Weiner)400Nt800NtAUG----------------------UGA-----------------------UAAUGA,UAG易被漏讀，錯(cuò)讀UAA能嚴(yán)格終止14KdCp97%38KdIp3% X174(F.Sanger,1977)Alternatedifferentreadingframe5387bp11genes3mRNA9peptidesC=5387bpc=11×2000bp---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----ABATGCCN----NNATAA --------------TCAUGCCCAAACUAGGC--------------StartStopstopstartAlternatedifferentreadingframe ---AUG--------TCAUGCCCAA----AUGAGGC--------------Vp2StartSelectiondifferentstartcodonorstopcodon(SimianVirus40SV40)SV40Vp1StartVp3StartVp1Vp2Vp3 2.4.2.2.種類※I類；反向重疊基因（重疊基因分布在同一DNA區(qū)域的不同單鏈上）IAICIDIB方式？!?!功能？! ※II類；同向重疊基因（重疊基因分布在同一DNA區(qū)域的同一單鏈上）方式？IIAIIBIICIID b)遺傳信息量的估算突變效應(yīng)的鑒定表達(dá)調(diào)控的理論發(fā)展c)豐富和發(fā)展了基因的概念(部分回答C=c)2.4.2.3.重疊基因的生物學(xué)意義a)原核生物進(jìn)化的經(jīng)濟(jì)原則(較小的C值編碼較多的基因信息) 2.4.3重復(fù)基因(Repetitivegene) 135001.7×1054.2×106bpK.C.2×10-68×10-23×10-19Cot1/22.4.3.1.重復(fù)序列的發(fā)現(xiàn)與證實(shí)Why? 單一序列長(zhǎng)度愈小（重復(fù)度愈大）kineticcomplexity(K.C.）愈小Cot(1/2)值愈小，復(fù)性愈快poly(A)K.C.=1Cot(1/2)=2×10-6T4DNAK.C.=1.7×105Cot(1/2)=0.3E.coliDNAK.C.=4.2×106bpCot(1/2)=9 C0t(1/2)ofanygenomeDNAC0t(1/2)ofE.ColiDNAKineticComplexityofanygenomeDNAKineticComplexityofE.ColiK.C.與Cot(1/2)值呈正比 K.C.與Cot(1/2)值呈正比poly(A)K.C.=1;Cot(1/2)=2×10-6比例常數(shù)K＝K.C./Cot(1/2)=1/2×10-6=5×105K.C.=K×Cot(1/2)T4DNAK.C.=1.7×106;Cot(1/2)=0.3比例常數(shù)K≈1.7×106/0.3=5×105E.coliDNAK.C.=4.2×106bp;Cot(1/2)=9比例常數(shù)K≈4.2×106/9=5×105 在特定的實(shí)驗(yàn)條件下盡管不同的DNA分子K.C.值不同，Cot(1/2)也不相同，但他們的比例常數(shù)是相同的K=5×105K.C.與Cot(1/2)值呈正比K.C.=K×Cot(1/2)Bp＝(bp×L/M×S)×(M×S/L)任一DNA分子K.C.＝5×105×Cot(1/2) 1CotCt/C013/605/61/60.110含有復(fù)性速率不同的兩個(gè)以上的組分1/6C/C0=Cot(1/6)1025/6C/C0=Cot(5/6)●真核生物復(fù)性動(dòng)力學(xué)研究理想曲線Cot(1/2)=1K.C.=K×Cot(1/2)＝5×105×Cot(1/2)=5×105(Britten&Kohne1968)參與復(fù)性的組分是單質(zhì)的1/6Ct/C0=Cot(1/6)1025/6Ct/C0=Cot(5/6) ●真核生物復(fù)性動(dòng)力學(xué)研究C0t1/6C/C0=Cot(1/6)102CalfthymusDNA含有兩個(gè)以上的K.C.不同的組分5/6C/C0=Cot(5/6)Ct/C06105／61／63／610－2E.ColiDNA30000.0340%60%103CalfthymusDNA C0t(1/2)值矯正40%×0.03=0.01260%×3000=1800C0t(1/2)ofE.ColiDNA=6KineticComplexityofE.Coli=4.6×106C0t(1/2)ofanygenomeDNAC0t(1/2)ofE.ColiDNAKineticComplexityofanygenomeDNAKineticComplexityofE.Coli 60%DNA的總長(zhǎng)度=單一序列的KineticcomplexityX=13.8×108bp40%DNA的總長(zhǎng)度(chemicalcomplexity)13.8×108bp×4/6=9.2×108bp1800X64.6×106= 40%DNA中單一序列的Kineticcomplexity40%DNA序列中單一序列的重復(fù)次數(shù)（F）0.012Y64.6×106=Y=9200bpRepetitivefrequency=C.C/K.C=9.2×108bp/9200bp=100,000copies 40%DNA的總長(zhǎng)度(chemicalcomplexity)XK.C=1800×5×105bp=9×105bp9×105bp×4/6=6×108bp60%DNA的總長(zhǎng)度=單一序列的KineticcomplexityC0t(1/2)值矯正40%×0.03=0.01260%×3000=1800K.C.=K×Cot(1/2) 40%DNA中單一序列的Kineticcomplexity40%DNA序列中單一序列的重復(fù)次數(shù)（F）Repetitivefrequency=C.C/YK.C=6×108bp/6000bp=100,000copiesYK.C=0.012×5×105bp=6000bpC0t(1/2)值矯正40%×0.03=0.01260%×3000=1800 2.4.3.2重復(fù)序列復(fù)性的相對(duì)性D.S.DNA94℃S.S.DNARenatureatlowC0t(1/2)Hydroxyapatitecolumn高度重復(fù)的D.S.DNATm低于該部分天然DNA值S.S.DNARenatureatmiddleC0t(1/2)How? S.S.DNARenatureathighC0t(1/2)單一序列的D.S.DNATm幾乎接近該部分天然DNA值中度重復(fù)的D.S.DNATm稍低于該部分天然DNA值? Tm接近天然D.SDNA的TmTm低于天然D.SDNA的Tm單一序列的S.S.DNA復(fù)性D.S.DNA復(fù)性D.S.DNA重復(fù)序列的S.S.DNA高C0t(1/2)低C0t(1/2) 結(jié)果表明：a)Non-repetitiveS.S.DNARenaturedbyexactlypairingb)RepetitiveS.S.DNAMorerenaturedbypartiallypairingMoreinexactlypairingandmis-pairing天然DNA與復(fù)性DNA之間比較?Tm相差1－1.5度時(shí)，預(yù)計(jì)約有1％的堿基錯(cuò)配 部分配對(duì)，錯(cuò)誤配對(duì)愈多，變性時(shí)Tm值愈低PCR,分子雜交中，雜交溫度（復(fù)性）一般為Tm－(25~30℃)=55~65℃高于55~65℃，為高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件（用于單一序列探針）低于55~65℃，為低嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件（用于重復(fù)序列探針）Why? 利用水稻基因的探針與玉米根尖染色體細(xì)胞學(xué)制片進(jìn)行原位分子雜交時(shí)(FISH)，使用玉米C0tDNA進(jìn)行預(yù)雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：玉米DNAC0t值分別為10，50，100時(shí)的雜交效果不同，為什么？C0t=10C0t=50C0t=100 2.4.3.3.重復(fù)序列分類a)高度重復(fù)序列(Highrepetitivesequence)MicrosatelliteDNA2-10bp/copy105-106copies/genomeC0t(1/2)<0.001多為串聯(lián)重復(fù)排列分布于著絲點(diǎn),端粒區(qū),結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)heterochromatin5-50copies/genomeMinisatelliteDNA(Variablenumbertandemrepeats.VNTR) 104bpfragmentCsClgradientcentrifugationSequenceinsatelliteDNASeacrab2ATATAT…..Drosophila5ATAATATAAT…..Mouse9GAAAAATGAGAAAAATGAbpofrepeatunitsequenceProkaryoteEukaryote(GC%)42413455MOUSECALF 高度重復(fù)序列（micro-satellite）不編碼結(jié)構(gòu)基因（功能？）無選擇壓力（multipleallele可保留在群體中）（有效的分子標(biāo)記，SSRsimplesequencerepeat）CNV(copynumbervariation)! b)中度重復(fù)序列(middlerepetitivesequence)0.1-1Kb/copy10-104copies/genomeC0t(1/2)~0.001-0.1rDNAtDNAAlufamilyHistonegenecluster rDNAgenefamilySeaurchin450copiesTobacco750copiesDrosophila100copiesT18sT5.8sT28sNT18sT5.8sT20s32s28s5.8s45s41s18s不同的生物不同發(fā)育時(shí)期會(huì)發(fā)生不同程度的擴(kuò)增5srDNA5s5s5s5s5s上萬次重復(fù) 靈長(zhǎng)類動(dòng)物特有的Alufamily人類500,000copies分布于非重復(fù)序列間，占基因組5－6％Function?300bp300bp300bp6000bp6000bp6000bp6000bpDRDRIRIRAGCTAlusiteAcopyofAlufamilyTransposon?遺傳性疾病Aluexon的發(fā)現(xiàn)，表明Alu單元在不危及基因組完整的前提下，具有增強(qiáng)基因組編碼容量，產(chǎn)生新基因及調(diào)控多能性的進(jìn)化潛力 middlerepeatgene特點(diǎn)clustergenetandemgeneredundantgene拷貝重復(fù)，多量序列多為相似排列成束功能完全相同具有進(jìn)化的整體性，累積突變r(jià)DNAtDNAHistone數(shù)量性狀基因QTG（量多，微效?效等?累加）不等于中度重復(fù)基因 StructureofrepetitivesequenceofDNADRdirectrepeatsIRInvertedrepeatsATCGGCTATAGCCGATBilateralsymmetryATCGNNNNNGCTATAGCNNNNNCGATBilateralsymmetryATCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTandemdirectrepeatsATCGNNNATCGNNNNNNATCGTAGCNNNTAGCNNNNNNTAGCDisperseddirectrepeatsATCGNNNNNCGATTAGCNNNNNGCTAStem-looppalindrome----AAGCTT--------TTCGAA----HindIIIREMirrorStructure ATCGNNNNNNNNCGATATCGTAGCWhenS.S.DNAdNtscontainstwosequencesthatarecomplementary,andformahairpinorstem-loopstructure.StructureofInvertedrepetitivesequence(IR)ofDNA ATCGNNNNNCGATTAGCNNNNNGCTAATCGTAGCCGATGCTAInD.S.DNAsuchstructureconsistoftwocopiesofanidenticalsequencepresentintheinvertedorientation c)單拷貝序列(singlecopysequence,1-3copies)低等真核生物10-20%高等植物80%repetitivesequence高等動(dòng)物50%多為結(jié)構(gòu)基因 2.4.3.4.重復(fù)序列形成的理論a)滾環(huán)擴(kuò)增—突變(Amplification-Mutation)Mutationinsertioncyclingamplification5‘切離環(huán)化3‘3‘3‘滾環(huán)復(fù)制 DNA→RNA→DNAmRNA/cDNADScDNAb)反轉(zhuǎn)座插入(retro-transposition) 跳躍復(fù)制saltatoryreplicationCAACMutationin4siteInsertCInserttriplemutationSaltatoryreplication9bprepeat27bprepeat58bprepeat58bprepeat116bprepeat 基因的重復(fù)可以通過復(fù)制產(chǎn)生（duplication）復(fù)制后的拷貝發(fā)生突變和突變累積(divergence)形成基因簇genecluster分化成執(zhí)行不同功能的基因 Geneduplicationisamajorforceinevolution抗病基因簇的形成 不對(duì)稱交換(unequalcrossing-over) unequalcrossing-over5Units5Units6Units4Units 基因組比較研究禾本科植物基因組比較 ●基因組比較研究表明；5×RicegenomeMaizegenome40×RicegenomeWheatgenome但基因組成，排列表現(xiàn)驚人的相似差異多存在于repetitivesequence﹤﹤ 2.4.4.間隔基因（splittinggene）PhillipSharp&RobertsAd2(1977)（minirevolution）RichardJ.RobertsPhillipA.SharpNobelPrize1993PierreChambon(France)(1977)ovalbuminofchickenEukaryoticcellulargeneisalsosplit2.5.4.1.間隔基因的發(fā)現(xiàn) PhillipA.SharpNobelPrize1993（49y）2006.2.13布什給PhilipSharp頒發(fā)國(guó)家科技獎(jiǎng)?wù)略@得40項(xiàng)獎(jiǎng)勵(lì)，擁有4個(gè)院士稱號(hào)（美國(guó)科學(xué)院、美國(guó)文理科學(xué)院、美國(guó)醫(yī)學(xué)研究院、美國(guó)哲學(xué)研究院） E.coliKeop=1eop=10-4ofλkefficiencyofplating(eop)=10-3ofλcE.coliCλphageeop=1●限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1965Arber.W a)E.colirestrictionalienDNAwithrestrictionendonuclease(RE)b)Modificationenzymeinhostc)AlienDNAfateofberestrictedorbemodifiedd)TherearedifferentREindifferenthostofbacterialWernerArberNobelPrize1978 lRestrictionEndonuclease的種類 ●Splittinggene的證實(shí)1977PierreChambonOvalbumincDNAasprobeEcoRIHindIIIOviductDNAErythrocyteDNAcDNA中沒有HindIII，EcoRI切點(diǎn)?。?Splittingseq.inthe5’endofHexoncpgeneofAd2DNAofAd2+EcoRI&HindIIImRNAofHexoncpSharpgroupRobertsgroup1977AndpresentationinCSHPNAS74:3173,1977 TotalDNAofchickencDNA7DNAloopChambonwasinspiredbyBerget’sreportBerget,S.M.,C.Moore,andP.Sharp.1977.PNAS74;3171-3175 OvalbumincDNAREmapHinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIV(NoEcoRIHindIIIREsite)thecDNAprobebedigestedbyHinfIIIandPstILabelingwithp32ProbeAProbeCProbeB ProbecDNAABCOviducttotalDNADigestedwithEcoRIandHindIIIpresume HinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIVEcoRI,HindIIIEcoRI,HindIIISpacerSpacercDNAmRNApresumeHinfIHinfIIHeaIIIHinfIIIPstIHinfIVDNA轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄雖機(jī)會(huì)錯(cuò)過但推論正確