分選效果的影響因素

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1、分選效果的影響因素分選純度：1.液滴的分選模式。（如果要保證分選的純度則選擇purity模式，如果要盡可能分到更多的細胞則選擇yield模式，但這會使得率下降）2.確保液滴延遲時間準確。（用bead調(diào)節(jié)Dropdelay>98%，保證細胞分選純度）3.選擇合適的進樣速度，保證效率>75%，70um噴嘴流速一般不超過20000cell/s，100um噴嘴流速一般不超過6000cell/s。（按具體情況決定，一般最佳分選速度=1/(3-4)*DDF（DDF-液滴振蕩頻率）4.團塊影響和門的設(shè)定。（在流式圖上清

2、晰地選擇目的細胞，上樣前用40或70um無菌濾膜進行過濾，去除團塊，保證樣品為單細胞懸液）5.液流穩(wěn)定性，液流的穩(wěn)定決定著Dropdelay的準確度。（如果不穩(wěn)定，請用無菌水沖洗，待液流穩(wěn)定后再分選。70um噴嘴換成100um噴嘴時，因為壓力減少，所以需要1h左右穩(wěn)定液流）分選得率：1.確保液滴延遲時間準確。（不準確的液滴延遲會使大量的非目的細胞被分選，純度下降的同時導(dǎo)致得率下降）2.選純度（purity）模式會犧牲得率。（如果陽性細胞和陰性細胞粘在一起，純度模式會將其丟失），如果不需要高純度，可以選擇富

3、集（Yield）模式。3.盡量選擇70um的噴嘴，同樣體積的溶液，比其它大的噴嘴可以得到更多的細胞。但還是要根據(jù)具體樣品情況選擇噴嘴，易碎的細胞盡量選用低壓和大噴嘴。（噴嘴越大，形成的液滴越大，對細胞的沖擊越小，對細胞的保護越好）4.選擇合適的進樣速度，保證效率>75%。（速度越大，效率越低）分選活性：1.與儀器的無菌清洗有關(guān)。要用無菌水長時間沖洗干凈。（常規(guī)開機時先用酒精沖洗15min，流速為1，然后用無菌水沖洗30-45min，流速為11。關(guān)機時先用clean沖洗15min，流速為1，然后用無菌水沖洗

4、30-45min，流速為11）2.與壓力有關(guān)。對于容易破碎的細胞，盡量采用低壓和大噴嘴（包裹細胞的液滴越大，對細胞的沖擊越小，對細胞的保護越好）。1.與噴嘴大小有關(guān)。（分選分的是液滴，而不是細胞，大噴嘴形成大液滴，液滴越大，在加電偏轉(zhuǎn)時，液滴所起的主導(dǎo)作用較大，小噴嘴形成小液滴，往往在加電偏轉(zhuǎn)時，細胞所起的主導(dǎo)作用較大，更有可能打在管壁上，造成細胞破碎，且大噴嘴的壓力小，對細胞傷害小）2.與細胞經(jīng)過的管壁光滑度有關(guān)。（尤其是上樣針，需定期由工作人員更換）3.與收集管中培養(yǎng)液的液面有關(guān)。(調(diào)節(jié)時保證液滴打在

5、液面上，防止細胞打在管壁上影響活性。建議15ml收集管液面高于3ml，5ml收集管液面高于1ml)4.與細胞本身的活性有關(guān)。5.樣本的制備方法。（建議在冰上孵育，且放置時間不要過久）