r&d常見問題之eliot酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)

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1、R&D產(chǎn)品常見問題之ELIot酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)問：什么是ELIot？答：R&DSystems的ELIot測試采用了ELISA技術(shù)。先將對某一細(xì)胞因子專一的單克隆抗體固定于微孔板的PVDF膜上，再將經(jīng)適當(dāng)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞移液到微孔中，然后將整個微孔板放置在保濕的370CCO2培養(yǎng)箱中溫育特定的時間；在溫育的這段時間里，固定化的抗體與它們周圍分泌細(xì)胞析出的細(xì)胞分子結(jié)合；洗掉細(xì)胞和未結(jié)合的分子，加入對這一細(xì)胞因子有特異性的生物素化的多克隆抗體；清除未結(jié)合生物素化的抗體，加入經(jīng)streptavidin共軛的堿性磷酸酶；將未結(jié)合的酶從反應(yīng)中洗除后，

2、再加入底物溶液（BCIP/T）；一個藍(lán)黑色的沉淀（斑點(diǎn)）在細(xì)胞因子產(chǎn)生的位置形成，每一斑點(diǎn)代表了分泌特定細(xì)胞因子的細(xì)胞。這些斑點(diǎn)可用自動讀板系統(tǒng)（不同于普通讀光儀）讀出；或者，這些斑點(diǎn)也可用立體顯微鏡手控讀出。問：ELIot與ELISA有何不同？答：ELISA實(shí)驗(yàn)測量的是樣本中某一細(xì)胞因子的總量（一般表示為pg或ng/mL）；ELIot實(shí)驗(yàn)并不測定樣本中某一細(xì)胞因子的量，而是測定有多少細(xì)胞在分泌某一細(xì)胞因子。問：ELIot與組件有何不同？答：R&DSystems的ELIot試劑盒含有：對某一細(xì)胞因子有特異性的單克隆抗體（這一抗體已預(yù)

3、先固定在微孔板的PVDF膜上）、生物素化的檢測抗體，Streptavidin共軛的堿性磷酸酶、BCIP/T產(chǎn)色物、和重組細(xì)胞因子陽性對照。試劑盒備有試驗(yàn)所需所有的用品，試驗(yàn)者不需再進(jìn)行優(yōu)化。?R&DSystems的ELIot開發(fā)試劑分為兩個必需組分，必須分別購買對細(xì)胞因子具有特異性的開發(fā)組件和ELIot藍(lán)色組件。對細(xì)胞因子專一的開發(fā)組件包括對細(xì)胞因子特異的捕獲抗體和檢測抗體；ELIot藍(lán)色組件（目錄#SE002）對所有R&DSystems的對細(xì)胞因子特異的開發(fā)組件都適用，它包含Streptavidin-堿性磷酸酶和BCIP/T產(chǎn)色物

4、。問：我是否可只使用ELIot試劑盒中的部分微孔板？答：因?yàn)閹в蠵VDF膜的微孔板很靈敏，我們不能將微孔板做成條狀的形式。如溫育多次，我們將不能保證使用微孔板所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；因?yàn)槲⒖装宀辉贌o菌，所以未使用的微孔可能有污染。我們并不擔(dān)心第一次使用時污染會有，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的細(xì)胞培養(yǎng)液都含抗菌素，而溫育時間又相對較短。我們選擇帶有的PVDF微孔板是因?yàn)樗鼙葮?biāo)準(zhǔn)ELISA級別的聚丙乙烯(polystyrene)微孔板提供更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。問：我需要用多少細(xì)胞？答：這個問題比較難回答，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而異。使用多少細(xì)胞有許多變量：比如細(xì)胞的大小、細(xì)

5、胞的類型、分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的多少、誘導(dǎo)細(xì)胞的方法等。剛開始時，需要做一些細(xì)胞的稀釋（如，將每孔10,000,000個細(xì)胞稀釋到100,000甚至到10,000個細(xì)胞）來決定可形成明顯斑點(diǎn)的最佳細(xì)胞數(shù)。例如，如果微孔中的細(xì)胞已達(dá)到單層融合狀而大部分細(xì)胞分泌待測的細(xì)胞因子，形成的斑點(diǎn)就很難分開，這樣就很難定量檢測到分泌所測的細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)；在這種情況下，應(yīng)做一系列稀釋(titration)，降低細(xì)胞數(shù)。如果在同樣的單層融合狀細(xì)胞中只有少數(shù)細(xì)胞分泌待測的細(xì)胞因子，形成的斑點(diǎn)就會很明顯，就很容易被定量測定；在第這種情況下，細(xì)胞數(shù)目就是合

6、適的。所以，必須針對不同細(xì)胞類型和誘導(dǎo)方法來確定每孔中應(yīng)加入細(xì)胞的最佳數(shù)目。問：在一個微孔板上可做多少個樣本？答：這是基于96孔微孔板的測試。除去陽性對照、陰性對照、本底（空白）和檢測抗體對照外，還剩下88孔，可做44個樣本（每個樣本做雙份）。