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1、.酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)介紹一、ELISPOT技術(shù)概述1.技術(shù)原理和技術(shù)特點ELISPOT全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測，英文：（Enzyme-linkedImmunospotAssay）。它結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細胞分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來（SedgwickJD2005）。該技術(shù)檢測細胞因子具有三大優(yōu)點：其一，靈敏度高。在一百萬個陰性細胞中只要有一個分泌細胞因子的陽性細胞即可被檢測出
2、來。這是目前為止，最為靈敏的檢測技術(shù)，靈敏度比傳統(tǒng)的的ELISA方法高2-3個數(shù)量級。其二，單細胞水平，活細胞功能檢測。ELISPOT檢測的是單個細胞分泌，而非細胞群體的平均分泌。在檢測的過程中，有活細胞培養(yǎng)與抗原刺激階段，檢測的是活細胞的功能，而非死細胞的遺留物。其三，操作簡便經(jīng)濟，可以進行高筒量篩選。ELISPOT沒有復雜的細胞體外擴增過程，不使用同位素，不需要大型的、專門的實驗儀器設備。按照標準化的實驗操作，一個實驗者可以同時處理數(shù)百個樣品，效率遠遠高于其它檢測方法（KalyuzhnyAE2005）。實驗設計在
3、96孔培養(yǎng)板上進行，直接以培養(yǎng)板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纖維素膜為基質(zhì)，包被上特異性的單克隆抗體，用以捕獲細胞分泌的細胞因子。（由于涉及到細胞培養(yǎng)的過程，對單克隆抗體的要求要遠高于ELISA中的捕獲抗體，該抗體需要無毒，不含內(nèi)毒素，親和力高等特點。）之后，在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入細胞培養(yǎng)基（現(xiàn)在無血清ELISPOT技術(shù)已經(jīng)成熟，培養(yǎng)基中可以不再含有血清）、待檢測的細胞以及抗原刺激物進行培養(yǎng)。在特異性的抗原或者非特異性的有絲分裂原的刺激下，數(shù)小時之內(nèi)，T細胞就會開始分泌各種細胞因子。細胞因子當即就被位于細胞下方的膜上
4、的單克隆抗體所捕獲。在洗去細胞之后，被捕獲的細胞因子可以與生物素標記的第二抗體結(jié)合，然后用酶標親和素再與生物素結(jié)合，進行化學酶聯(lián)顯色，就可以在膜的局部形成一個個圓形的斑點。每一個斑點就對應了當初一個分泌細胞因子的細胞，這些細胞被稱為斑點形成細胞（SpotsformingcellsSFCs）。統(tǒng)計膜上的斑點的數(shù)目，再除以當初加入孔內(nèi)的細胞總數(shù)，就可以計算出陽性細胞的頻率。其實驗原理如下所示：1.特異性的單克隆抗體包被在培養(yǎng)板的孔底部；2.封閉所能結(jié)合單瓣的其他部位；3.加入細胞及以及刺激物培養(yǎng)，陽性細胞分泌細胞因子，被
5、細胞下方的單克隆抗體捕獲；4.移出細胞，洗滌；5.加入生物素標記的第二抗體（和雙抗體夾心法ELISA類似）；6.加入酶標鏈霉親和素；7加入顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點；8.斑點計數(shù)（可以人工計數(shù)，也可以使用自動的讀板儀來計數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。2.ELISPOT的發(fā)展歷史ELISPOT方法從創(chuàng)立至今已經(jīng)有20多年的歷史了。1983年，在地球南北兩個半球地理位置...相距遙遠的兩個研究小組幾乎同時、獨立的創(chuàng)立了這項技術(shù)。一個研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人
6、是當時正在當?shù)豈argaret女王醫(yī)院兒童醫(yī)學研究所攻讀博士學位的JonathonD.Sedgwich（SedgwickJDet.al.,1983）。另一個研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學醫(yī)學微生物系的學者CecilC.Czerkinsky（CzerkinskyCCet.al.,1983a）。前者開創(chuàng)ELISPOT方法是為了研究B淋巴細胞分泌IgM抗體的情況（HoltPGet.al.,1984；SedgwickJDet.al.,1984）；而后者除了用于研究B淋巴細胞分泌抗體的情
7、況（CzerkinskyCCet.al.,1983b;1983c），還應用于大腸桿菌分泌腸毒素（CzerkinskyCCet.al.,1983a）和成纖維細胞分泌纖維連接蛋白（CzerkinskyCCet.al.,1984）的研究中。雖然研究的對象不一樣，但是該實驗技術(shù)所涉及的原理以及方法步驟和我們現(xiàn)在的標準ELISPOT幾乎完全相同。這二十多年來，ELISPOT基本技術(shù)并沒有什么重大變化，但是技術(shù)進步一直沒有停頓，實驗材料的改進了，實驗靈敏度與重復性提高了，實驗應用領域也拓寬了。1)底板材質(zhì)的改進ELISPOT技術(shù)
8、從創(chuàng)立之初，檢測底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此實驗的靈敏度有限。1985年，MollerSA和BorrebaeckCA將膜板引入ELISPOT中（MollerSAet.al.,1985），檢測的也是分泌抗體的陽性B細胞。他們引入的是硝酸纖維素膜，獲得了遠遠優(yōu)于塑料板的結(jié)果。1995年，荷蘭Utrecht大學免疫研究所的Sch
