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1、.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)介紹一、ELISPOT技術(shù)概述1.技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)ELISPOT全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)，英文：（Enzyme-linkedImmunospotAssay）。它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理，一句話(huà)概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色的方式將其表現(xiàn)出來(lái)（SedgwickJD2005）。該技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子具有三大優(yōu)點(diǎn)：其一，靈敏度高。在一百萬(wàn)個(gè)陰性細(xì)胞中只要有一個(gè)分泌細(xì)胞因子的陽(yáng)性細(xì)胞即可被檢測(cè)出
2、來(lái)。這是目前為止，最為靈敏的檢測(cè)技術(shù)，靈敏度比傳統(tǒng)的的ELISA方法高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。其二，單細(xì)胞水平，活細(xì)胞功能檢測(cè)。ELISPOT檢測(cè)的是單個(gè)細(xì)胞分泌，而非細(xì)胞群體的平均分泌。在檢測(cè)的過(guò)程中，有活細(xì)胞培養(yǎng)與抗原刺激階段，檢測(cè)的是活細(xì)胞的功能，而非死細(xì)胞的遺留物。其三，操作簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，可以進(jìn)行高筒量篩選。ELISPOT沒(méi)有復(fù)雜的細(xì)胞體外擴(kuò)增過(guò)程，不使用同位素，不需要大型的、專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。按照標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作，一個(gè)實(shí)驗(yàn)者可以同時(shí)處理數(shù)百個(gè)樣品，效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它檢測(cè)方法（KalyuzhnyAE2005）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在
3、96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行，直接以培養(yǎng)板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纖維素膜為基質(zhì)，包被上特異性的單克隆抗體，用以捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。（由于涉及到細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程，對(duì)單克隆抗體的要求要遠(yuǎn)高于ELISA中的捕獲抗體，該抗體需要無(wú)毒，不含內(nèi)毒素，親和力高等特點(diǎn)。）之后，在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入細(xì)胞培養(yǎng)基（現(xiàn)在無(wú)血清ELISPOT技術(shù)已經(jīng)成熟，培養(yǎng)基中可以不再含有血清）、待檢測(cè)的細(xì)胞以及抗原刺激物進(jìn)行培養(yǎng)。在特異性的抗原或者非特異性的有絲分裂原的刺激下，數(shù)小時(shí)之內(nèi)，T細(xì)胞就會(huì)開(kāi)始分泌各種細(xì)胞因子。細(xì)胞因子當(dāng)即就被位于細(xì)胞下方的膜上
4、的單克隆抗體所捕獲。在洗去細(xì)胞之后，被捕獲的細(xì)胞因子可以與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，然后用酶標(biāo)親和素再與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色，就可以在膜的局部形成一個(gè)個(gè)圓形的斑點(diǎn)。每一個(gè)斑點(diǎn)就對(duì)應(yīng)了當(dāng)初一個(gè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞，這些細(xì)胞被稱(chēng)為斑點(diǎn)形成細(xì)胞（SpotsformingcellsSFCs）。統(tǒng)計(jì)膜上的斑點(diǎn)的數(shù)目，再除以當(dāng)初加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，就可以計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞的頻率。其實(shí)驗(yàn)原理如下所示：1.特異性的單克隆抗體包被在培養(yǎng)板的孔底部；2.封閉所能結(jié)合單瓣的其他部位；3.加入細(xì)胞及以及刺激物培養(yǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，被
5、細(xì)胞下方的單克隆抗體捕獲；4.移出細(xì)胞，洗滌；5.加入生物素標(biāo)記的第二抗體（和雙抗體夾心法ELISA類(lèi)似）；6.加入酶標(biāo)鏈霉親和素；7加入顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；8.斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（可以人工計(jì)數(shù)，也可以使用自動(dòng)的讀板儀來(lái)計(jì)數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。2.ELISPOT的發(fā)展歷史ELISPOT方法從創(chuàng)立至今已經(jīng)有20多年的歷史了。1983年，在地球南北兩個(gè)半球地理位置...相距遙遠(yuǎn)的兩個(gè)研究小組幾乎同時(shí)、獨(dú)立的創(chuàng)立了這項(xiàng)技術(shù)。一個(gè)研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人
6、是當(dāng)時(shí)正在當(dāng)?shù)豈argaret女王醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)研究所攻讀博士學(xué)位的JonathonD.Sedgwich（SedgwickJDet.al.,1983）。另一個(gè)研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物系的學(xué)者CecilC.Czerkinsky（CzerkinskyCCet.al.,1983a）。前者開(kāi)創(chuàng)ELISPOT方法是為了研究B淋巴細(xì)胞分泌IgM抗體的情況（HoltPGet.al.,1984；SedgwickJDet.al.,1984）；而后者除了用于研究B淋巴細(xì)胞分泌抗體的情
7、況（CzerkinskyCCet.al.,1983b;1983c），還應(yīng)用于大腸桿菌分泌腸毒素（CzerkinskyCCet.al.,1983a）和成纖維細(xì)胞分泌纖維連接蛋白（CzerkinskyCCet.al.,1984）的研究中。雖然研究的對(duì)象不一樣，但是該實(shí)驗(yàn)技術(shù)所涉及的原理以及方法步驟和我們現(xiàn)在的標(biāo)準(zhǔn)ELISPOT幾乎完全相同。這二十多年來(lái)，ELISPOT基本技術(shù)并沒(méi)有什么重大變化，但是技術(shù)進(jìn)步一直沒(méi)有停頓，實(shí)驗(yàn)材料的改進(jìn)了，實(shí)驗(yàn)靈敏度與重復(fù)性提高了，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域也拓寬了。1)底板材質(zhì)的改進(jìn)ELISPOT技術(shù)
8、從創(chuàng)立之初，檢測(cè)底板都是使用的普通塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此實(shí)驗(yàn)的靈敏度有限。1985年，MollerSA和BorrebaeckCA將膜板引入ELISPOT中（MollerSAet.al.,1985），檢測(cè)的也是分泌抗體的陽(yáng)性B細(xì)胞。他們引入的是硝酸纖維素膜，獲得了遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于塑料板的結(jié)果。1995年，荷蘭Utrecht大學(xué)免疫研究所的Sch
