藥敏試驗(yàn).ppt

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抗菌藥物的敏感試驗(yàn)張德純教授病原生物學(xué)教研室 醫(yī)院感染近年來(lái)已成為全球性的突出問(wèn)題，其主要原因之一是抗菌藥物的使用不當(dāng)促進(jìn)耐藥菌在病人體內(nèi)和醫(yī)院環(huán)境中定植繁衍，進(jìn)而導(dǎo)致的交叉感染和內(nèi)源性感染日益增多。合理使用抗菌藥物的前提之一是要重視感染病原學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷和監(jiān)控抗感染治療的實(shí)驗(yàn)室服務(wù)。為臨床抗感染治療的藥物選擇以及療效的監(jiān)測(cè)和考核提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)是臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的重要職能之一。 藥物敏感試驗(yàn)包括體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)、體內(nèi)抗菌藥物活性的測(cè)定和藥物濃度的測(cè)定。體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)包括抑菌試驗(yàn)、殺菌試驗(yàn)、聯(lián)合藥敏試驗(yàn)和檢測(cè)細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素滅活酶。常用的體外抗菌藥物敏感試驗(yàn)有紙片擴(kuò)散法、稀釋法和E試驗(yàn)法。本章僅對(duì)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常用的體外藥敏試驗(yàn)的基本原理和方法進(jìn)行介紹。 一、臨床常用的抗菌藥物抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學(xué)合成藥物。1.青霉素類抗生素2.頭孢菌素類抗生素3.其他-內(nèi)酰胺類抗生素4.氨基糖甙類抗生素5.喹諾酮類抗生素6.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素7.四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素8.糖肽類抗生素9.磺胺類藥物及增效劑10.其他合成抗菌藥 二、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（一）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的意義抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（antimicrobialsusceptibilitytest,AST）意義在于：1.可預(yù)測(cè)抗菌治療的效果，既AST試驗(yàn)結(jié)果為“敏感”時(shí)，治療可能有效；試驗(yàn)結(jié)果為“耐藥”時(shí)，使用該藥物治療肯定失??；2.指導(dǎo)臨床醫(yī)生選擇使用抗生素，AST的結(jié)果往往在給予病人經(jīng)驗(yàn)性治療24~48h之后，若AST結(jié)果為“敏感”，該治療為有效，若結(jié)果為“耐藥”，即應(yīng)更換藥物； 3.提供所選擇藥物的依據(jù)；4.監(jiān)測(cè)耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染病的流行病學(xué)，控制和預(yù)防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。 （二）藥敏試驗(yàn)方法1紙片擴(kuò)散法1）K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法（1）原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上。紙片中所含有的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度。并與該藥對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。 2.抗菌藥物紙片：選擇直徑6.35mm的新華濾紙含藥物紙片，-20℃保存。3.培養(yǎng)基：用水解酪蛋白（Mueller-HintonMH）瓊脂。瓊脂厚度4mm。9cm內(nèi)徑的平板需傾注25-30ml瓊脂，7cm內(nèi)徑的平板需傾注15ml瓊脂。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌在MH瓊脂基礎(chǔ)上加入血清或血液。 4.操作步驟：接種在已分純的待測(cè)菌平板上挑取4~5個(gè)菌落35℃4~6h3~5mlMH肉湯中用肉湯調(diào)整菌液至15min內(nèi)0.5個(gè)麥?zhǔn)瞎埽?.5х108/ml）用無(wú)菌棉簽均勻涂布平板（涂布3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周）室溫5分鐘后貼紙片（各紙片中心相距應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm）35℃16-18h觀察結(jié)果 5.結(jié)果判斷：量取抑菌圈直徑抗菌藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)分為以下三級(jí)：敏感：表示測(cè)試菌能被測(cè)定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制或殺滅。中度敏感(中介)：指測(cè)試菌可被測(cè)定藥物大劑量給藥后在體內(nèi)能達(dá)到的濃度所抑制，或在測(cè)定藥物濃集部位的體液中，如尿中被抑制。耐藥：表示測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制。 6.影響因素（1）培養(yǎng)基的質(zhì)量，如PH、深度、硬度和表面濕度等；（2）藥敏紙片的質(zhì)量，含藥量和保存方式；（3）接種菌量正確與否是影響結(jié)果的重要因素之一，取決于比濁標(biāo)準(zhǔn)的配制，正確使用和保存；（4）試驗(yàn)操作質(zhì)量：接種細(xì)菌后貼片時(shí)5~15分鐘；（5）孵育條件，溫度和時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間16~18h,不要超過(guò)24h。7.質(zhì)量控制采用標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，和銅綠假單胞菌ATCC27853 2）直接紙片藥敏法由確證感染部位采集到的一些重要臨床標(biāo)本直接涂布接種MH瓊脂或5%羊血MH瓊脂，然后放置藥敏紙片。不僅可提早24h得出初步藥敏結(jié)果供臨床用藥參考，還有助于發(fā)現(xiàn)混合感染中的不同菌種、耐藥菌株以及病原菌的鑒定。但由于此法難以控制接種菌量，且標(biāo)本中可能存在多種細(xì)菌，因此還需要在病原菌分純后再用K—B法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充。 2稀釋法1）?肉湯稀釋法包括試管稀釋法和微量稀釋法。下面重點(diǎn)講述試管稀釋法（常量稀釋法）。（1）.?原理：以水解酪蛋白（MH）液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后種入待測(cè)細(xì)菌，定量測(cè)定抗菌藥物對(duì)被測(cè)菌的最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度（MBC）。最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration,MIC）：細(xì)菌生長(zhǎng)被完全抑制的最低藥物濃度為該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC。最低殺菌濃度（minimalbactericidalconcentration,MBC）：某抗菌藥物能殺滅99.9%以上測(cè)試菌時(shí)的最低藥物濃度。 試管編號(hào)：抗生素：2ml(512μg/ml)MH肉湯抗生素含量菌液(ml)：（1.5×107/ml)123456789101ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml2561286432168421---不加抗生素0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.11ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml(棄去)對(duì)倍稀釋：(2)方法 注意:設(shè)立對(duì)照管(肉湯對(duì)照管,待測(cè)菌生長(zhǎng)對(duì)照管和質(zhì)控菌生長(zhǎng)對(duì)照管.（3）結(jié)果判斷:不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥對(duì)該細(xì)菌的MIC.如第六管不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng),則MIC=原藥物濃度(512μg/ml)×稀釋倍數(shù)(1:32)=16μg/ml將所有無(wú)菌生長(zhǎng)的試管轉(zhuǎn)移到血平板，培養(yǎng)過(guò)夜，平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為藥對(duì)該菌的MBC.混勻35℃16~20h觀察結(jié)果 （4）影響因素：培養(yǎng)基、接種菌量、蛋白質(zhì)結(jié)合率、抗菌藥物的配制、結(jié)果觀察的時(shí)間等因素均能影響本試驗(yàn)的結(jié)果。（5）質(zhì)量控制：每批或每次實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)測(cè)試菌種類分別選用金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在同一試驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定。 2）瓊脂稀釋法（1）原理：將藥物混勻于MH瓊脂平板上，配制含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細(xì)菌，經(jīng)孵育后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含的藥物濃度測(cè)得MIC。（2）方法：將0.5麥?zhǔn)瞎芫合♂?0倍以多頭接種器接種于瓊脂表面，稀釋的菌液15min內(nèi)接種完畢，置35℃孵育16~20h。（3）質(zhì)量控制：原則同肉湯稀釋法，每個(gè)瓊脂平板應(yīng)同時(shí)接種標(biāo)準(zhǔn)菌株。 3E試驗(yàn)E試驗(yàn)是一種結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理對(duì)微生物藥敏試驗(yàn)直接定量的技術(shù)。（1）原理E試條是一條5mm×50mm的無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)的稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗生素抑制細(xì)菌的特定濃度，又稱抑制濃度（IC），它與MIC呈高度相關(guān)。 （2）方法菌液、平板接種等同紙片瓊脂擴(kuò)散法,待瓊脂平板完全干燥，用E試驗(yàn)加樣器或鑷子將試條放在已接種細(xì)菌的平板表面，試條全長(zhǎng)應(yīng)與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。采用NCCLS2002AST執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦孵育條件。（3）結(jié)果判讀：讀取橢圓環(huán)與E試驗(yàn)試條的交界點(diǎn)IC值。 E試驗(yàn) 細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)抑菌圈含藥試條最低抑菌濃度 4聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)（1）聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的方法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的方法很多，其中紙片法最為常用。下面就介紹紙片法的試驗(yàn)方法。與紙片擴(kuò)散法類似。先將試驗(yàn)菌均勻涂布于培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，放置5分鐘，待平板表面水分吸收后，將兩種含藥紙片貼于平板上，兩紙片中心距離2--4mm左右。然后35℃孵育過(guò)夜，取出觀察結(jié)果。 2）結(jié)果判斷聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)可出現(xiàn)四種結(jié)果：A.無(wú)關(guān)作用：甲+乙=甲單或乙單B.拮抗作用：甲+乙＜甲單或乙單C.相加作用：甲+乙=甲單+乙單D.協(xié)同作用：甲+乙＞甲單+乙單 A.無(wú)關(guān)作用：甲+乙=甲單或乙單細(xì)菌對(duì)兩藥均耐藥細(xì)菌對(duì)甲耐藥對(duì)乙敏感細(xì)菌對(duì)兩藥均敏感，抑菌環(huán)交界角尖銳。 B.拮抗作用：甲+乙＜甲單或乙單細(xì)菌對(duì)甲藥耐藥，對(duì)乙藥敏感，甲藥對(duì)乙藥發(fā)生切割狀拮抗現(xiàn)象。細(xì)菌對(duì)甲乙兩藥均敏感，乙藥對(duì)甲藥發(fā)生扇圓形拮抗現(xiàn)象。細(xì)菌對(duì)甲乙兩藥均敏感，甲乙兩藥發(fā)生相互切割狀拮抗現(xiàn)象。 C.相加作用：甲+乙=甲單+乙單甲乙兩藥抑菌環(huán)交界角鈍圓。 D.協(xié)同作用：甲+乙＞甲單+乙單甲乙兩藥抑菌環(huán)交界角平直細(xì)菌對(duì)甲藥不敏感，乙藥抑菌環(huán)向甲藥擴(kuò)大。無(wú)抑菌作用的兩藥之間出現(xiàn)抑菌區(qū)。 思考題：1.最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的含義與用途。2.常用藥物敏感試驗(yàn)的方法、報(bào)告方式與影響因素。3.藥物敏感試驗(yàn)有何臨床意義？