淋巴細(xì)胞分離

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細(xì)胞分離原理與手段基于對細(xì)胞物理特性1細(xì)胞比重差異（自然沉降法、密度梯度離心法、改變細(xì)胞密度法）2細(xì)胞的粘附性（貼壁細(xì)胞對玻璃、塑料器皿的粘附，B細(xì)胞對尼龍棉的粘附）3細(xì)胞對滲透壓改變的敏感性（紅細(xì)胞對低滲敏感，低滲處理，能使其裂解）基于細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物1補(bǔ)體細(xì)胞毒分離法2免疫磁珠分離法3流式細(xì)胞術(shù)

1血液細(xì)胞的組成及比重外周血紅細(xì)胞粒細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞血小板淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞1.0931.030~1.0351.075~1.090(PBMC)1.092

2單個(gè)核細(xì)胞的特點(diǎn)單核細(xì)胞：貼壁生長，能吞噬羥基鐵粉淋巴細(xì)胞：懸浮生長1粘附力：B細(xì)胞——尼龍棉2細(xì)胞表面標(biāo)志物T細(xì)胞：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25等NK細(xì)胞：CD2、CD8、CD16、CD56等

3淋巴細(xì)胞分離的流程密度梯度離心法粘附去除改變細(xì)胞密度法E花環(huán)分離法尼龍棉分離法流式細(xì)胞術(shù)磁珠分離法23

4單個(gè)核細(xì)胞的分離—密度梯度離心法

5原理：外周血各種血細(xì)胞的比重不同，利用淋巴細(xì)胞分層液作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。密度梯度離心法

6Ficoll：1.077±0.001Percoll常用密度20%1.03130%1.04340%1.05650%1.06760%1.07770%1.090細(xì)胞比重血小板1.030~1.035單個(gè)核細(xì)胞1.075~1.090粒細(xì)胞1.092紅細(xì)胞1.093細(xì)胞比重分層液比重

7離心后PBMC紅細(xì)胞粒細(xì)胞Ficoll/60%Percoll稀釋外周血稀釋的血漿、血小板Ficoll/60%Percoll

8實(shí)驗(yàn)步驟1.采血，稀釋（外周血：稀釋液=1：2）2.在離心管中加入分層液，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血（Ficoll：稀釋血=1：2）

93.20℃，1500r/min，離心30min4.沿管壁周緣輕輕吸取PBMC層移入另一試管中5.加足量稀釋液充分洗滌，1800r/min離心10min，棄上清6.重復(fù)洗滌一次，1400r/min離心10min，棄上清7.適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)8.細(xì)胞活性檢測1

10淋巴細(xì)胞分離—吸附法和改變細(xì)胞密度法單核細(xì)胞：貼壁生長，能吞噬羥基鐵粉淋巴細(xì)胞不具有這些特點(diǎn)

11粘附去除法原理：單核細(xì)胞和粒細(xì)胞在37℃和Ca離子存在條件下能主動(dòng)粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠。采集的非粘附細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。方法：1、玻璃器皿吸附法2玻璃纖維柱法優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，對細(xì)胞損傷極少。缺點(diǎn)：B細(xì)胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細(xì)胞丟失。該法去除單核細(xì)胞后，大約95%的單個(gè)核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，活性大于95%。

12改變細(xì)胞密度法原理：單核細(xì)胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細(xì)胞密度增大。方法一：磁鐵吸引法方法二：羥基鐵-乳膠分層液法2

13T、B、NK細(xì)胞的分離T細(xì)胞能與STBC結(jié)合形成E花環(huán)——E花環(huán)分離T細(xì)胞B細(xì)胞對尼龍纖維特有的吸附能力——尼龍纖維分離B細(xì)胞淋巴細(xì)胞表面的標(biāo)志差異——免疫磁珠分離法與流式細(xì)胞術(shù)

14E花環(huán)分離法原理：人類T細(xì)胞表面上有能與綿羊紅細(xì)胞相結(jié)合的受體（E受體，CD2）,能與經(jīng)2-氨乙基異硫溴化物（AET）處理的綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，形成穩(wěn)定的、細(xì)胞體積和比重較大的E花環(huán)。

15實(shí)驗(yàn)步驟1AET-E花環(huán)實(shí)驗(yàn)：將分離的單個(gè)核細(xì)胞（20萬/ml)與等量的1%AET-SRBC混合，37℃水浴15min,每5min搖勻一次，然后分裝，每管2~3ml，低速離心（1000r/min)5min后，4℃冰箱45分鐘。2T、B細(xì)胞分離：淋巴細(xì)胞+SRBC懸液→加入分層液→T細(xì)胞形成E花環(huán)而沉于管底→懸液中為B細(xì)胞。3T細(xì)胞分離：取沉淀于管底的E花環(huán)，用Hank’s液洗一次后，加雙蒸水3ml處理3s，低滲裂解E-花環(huán)周圍SRBC，立即加3.5%NaCl溶液1ml，使還原為等滲，低速離心沉淀，即的富含T淋巴細(xì)胞群。

16試劑配制AET溶液：稱取AET粉劑402mg,溶于10ml去離子水中，用4mol/LNaOH溶液約9～10滴，調(diào)至pH9.0，用0.2μm濾膜過濾除菌。用前臨時(shí)配制。AET-SRBC的制備：1SRBC中加等滲鹽溶液（1:4），1800r/min離心5min，連續(xù)洗滌5次2取壓積的SRBC，加入新鮮配制的pH9.0的AET溶液（1:4），置37℃水浴15min，每隔5min搖勻一次。3加入預(yù)冷無菌等滲鹽溶液，1800r/min離心5min，連續(xù)洗滌5次，4用含小牛血清的RPMI-1640液配成10%AET-SRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。使用時(shí)用10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至1%；

17原理：B細(xì)胞在37℃時(shí)易粘附于尼龍棉（聚酰胺）纖維上，而T細(xì)胞不具此能力。方法：淋巴細(xì)胞→通過聚酰胺纖維管→洗脫下來的是T細(xì)胞。尼龍纖維分離法

18磁珠分離法原理：1磁性微珠，可結(jié)合不同的生物大分子物質(zhì)（抗原、抗體、核酸等）；2在液相中，受外加磁場的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。基本步驟：首先將抗特異細(xì)胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細(xì)胞反應(yīng)后，利用磁力的作用，使與致敏結(jié)合的細(xì)胞與其它物質(zhì)分離，達(dá)到純化、分離的目的。方式：陽性分離和陰性分離。陽性分離是直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞，陰性分離是利用磁珠去除無關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以分離

19淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)志CD抗原特異性CD2E受體、全部T細(xì)胞和部分NK細(xì)胞CD3成熟T細(xì)胞CD4Th細(xì)胞、Mφ、HIV受體CD8Tc細(xì)胞、NK細(xì)胞的亞型CD25IL-2受體、活化T細(xì)胞CD16、CD56NK細(xì)胞

20單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球Biomag抗CD3磁球磁球結(jié)合T細(xì)胞加入B和T細(xì)胞中負(fù)向選擇正向選擇磁架進(jìn)行分離直接法對細(xì)胞進(jìn)行分類間接法對T細(xì)胞進(jìn)行分離

21陽性分選優(yōu)點(diǎn)：純度高，回收率高，操作迅速、簡便。陰極分選使用范圍：1去除不需要的細(xì)胞2缺乏針對目的細(xì)胞的特異性抗體3不需要抗體和目的細(xì)胞結(jié)合4復(fù)合分選的一部分

22實(shí)用范圍：主要用于細(xì)胞亞群的分選或者得到高純度非常稀有的細(xì)胞。主要方式：1去除后再陽性分選細(xì)胞亞群的分選，可以先磁性標(biāo)記非目的細(xì)胞，去除分選后對陰性組分再行磁性標(biāo)記和陽性分選。2多重分選——多次陽性分選根據(jù)多種表面標(biāo)志磁性分選細(xì)胞復(fù)合分選

23又叫熒光激活細(xì)胞分離法。原理：細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測區(qū)進(jìn)行測定。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)室噴嘴處流出時(shí)，超聲振蕩動(dòng)液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴(4000個(gè)/s)，每小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號(hào)，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞的類型。流式細(xì)胞術(shù)

24激發(fā)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)熒光激活細(xì)胞分離儀分離法檢測與訊號(hào)處理系統(tǒng)細(xì)胞流動(dòng)系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)

25操作方法1.將分離的單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×107/ml；2.加適量熒光抗原（NK細(xì)胞特異性的抗原為CD16、CD56；T細(xì)胞CD3），4℃孵育30min，用RPMI-1640培養(yǎng)基洗2次；3.用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在散射光參數(shù)圖上選取淋巴細(xì)胞群，在熒光參數(shù)圖上選取綠色熒光陽性的細(xì)胞進(jìn)行分選。

26總結(jié)T細(xì)胞分離1E花環(huán)分離取沉淀，低滲裂解，洗滌2磁珠分離法或流式細(xì)胞術(shù)B細(xì)胞分離E花環(huán)分離取上清，磁珠分離標(biāo)記CD16或CD56NK細(xì)胞分離E花環(huán)取上清或尼龍纖維分離液，磁珠或流式細(xì)胞術(shù)分離T細(xì)胞亞型分離T細(xì)胞分離的基礎(chǔ)上，磁珠分離法或流式細(xì)胞術(shù)淋巴細(xì)胞

27淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)

28淋巴細(xì)胞的保存（1）短期保存：用含有10～20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640培養(yǎng)液可保存數(shù)周。（2）長期保存：在保護(hù)劑二甲基亞砜中于液氮（-196℃)中保存。其過程是：先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含有10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，4℃緩沖，-20℃結(jié)冰，轉(zhuǎn)移-80℃過夜，繼而進(jìn)行降溫(-196℃)冷凍。（3）復(fù)蘇：將其從液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后加入10倍的培養(yǎng)液混勻，低速離心，洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力。

29淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)條件：（1）無菌（2）恒溫：培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37±0.5℃（3）氣體環(huán)境：02和C02。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2～7.4。（4）培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)基、培養(yǎng)用無機(jī)鹽、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴細(xì)胞分離液、植物凝集素(PHA)和白細(xì)胞介素等。

30操作步驟：1、洗滌將收集到的淋巴細(xì)胞集中于離心管中用培養(yǎng)液洗滌兩次，分別以2500和2000rpm離心各10min，棄上清，之后進(jìn)行接種。2、細(xì)胞接種細(xì)胞接種通常是在無菌室超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精燈火焰區(qū)進(jìn)行。3、搖床培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)瓶放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。從72h開始每48h添加等體積的新鮮培養(yǎng)液。

31細(xì)胞活力的測定——臺(tái)盼藍(lán)染色法原理常用方法是臺(tái)盼藍(lán)染色法。這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞而使細(xì)胞著色（藍(lán)色）步驟：1、制備單細(xì)胞懸液。并作適當(dāng)稀釋(106細(xì)胞/ml)2、染色：細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9:1混合混勻。3、計(jì)數(shù)：在三分鐘內(nèi)，用計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞結(jié)果統(tǒng)計(jì)：鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。根據(jù)下式求細(xì)胞活力：活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100

32Thankyou