六獸藥殘留檢測技術(shù)苯并咪唑類演示課件

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第六章獸藥殘留檢測技術(shù)第七節(jié)苯并咪唑類藥物殘留的危害分析與檢測方法

1一、概述苯并咪唑類(Benzimidazoles，BEN)是一種驅(qū)蟲劑,被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物寄生蟲的治療,同時(shí)還作為殺霉菌劑應(yīng)用于莊稼存貯和運(yùn)輸期間,使其免受霉菌污染。自20世紀(jì)60年代早期,美國合成噻苯達(dá)唑以來,已合成數(shù)百種苯并咪唑類驅(qū)蟲藥。噻苯達(dá)唑作為第一個(gè)商品化的苯并咪唑類藥物,曾廣泛用于世界各地,用以驅(qū)除各種動(dòng)物(如牛、綿羊、山羊、豬、馬、禽等)胃腸道寄生蟲。用于治療時(shí)可一次內(nèi)服給藥,也可以低濃度置于飼料中長期使用做預(yù)防用。

2由于噻苯達(dá)唑驅(qū)蟲作用不強(qiáng),用藥劑量較大,且驅(qū)蟲譜不廣,目前,已逐漸為其他苯并咪唑類藥物——阿苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、甲苯達(dá)唑、氟苯達(dá)唑等所取代。本類藥物的特點(diǎn)是驅(qū)蟲譜廣,驅(qū)蟲效果好,毒性低,甚至還有一定的殺滅幼蟲和蟲卵作用。苯并咪唑類中的帕苯達(dá)唑、坎苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑和奧芬達(dá)唑?qū)θ焉镌缙?約妊娠三周)綿羊的胎兒有致畸作用,因此用于孕畜時(shí)應(yīng)特別慎重。

3苯并咪唑類藥物的結(jié)構(gòu)式苯并咪唑類藥物是一個(gè)龐大的化學(xué)家族,包括噻苯達(dá)唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯類,以及苯并咪唑環(huán)上的各種側(cè)鏈取代物。苯并咪唑氨基甲酸酯類苯并咪唑環(huán)噻苯達(dá)唑的同系物

4苯并咪唑類藥物1、噻苯達(dá)唑(Thiabendazole,TBZ)2、坎苯達(dá)唑(Cambendazole,CAM)3、苯硫脲酯(Thiophanate)4、非班太爾(Febantel,FEB)5、芬苯達(dá)唑(Fenbendazole,FBZ)6、奧芬達(dá)唑(OxfendazoIe,OFZ)7、阿苯達(dá)唑(Albendazole,ABZ)8、甲苯達(dá)唑(Mebendazole,MBZ)9、奧苯達(dá)唑(Oxibendazole,OXI)10、氟苯達(dá)唑(Flubendazole,FLU)11、三氯苯達(dá)唑(Triclabendazole,TCB)

51、噻苯達(dá)唑(Thiabendazole,TBZ)別名噻菌靈、特克多、涕必靈、硫苯唑、噻苯咪唑、噻唑苯咪,為白色至奶黃色粉末,無臭,味微苦,微溶于水或乙醇,易溶于稀鹽酸或稀堿液中,不溶于氯仿或苯中。廣譜驅(qū)蟲藥,可能是抑制蟲體的延胡索酸還原酶。對動(dòng)物多種胃腸道線蟲均有驅(qū)除效果,對成蟲效果好,對未成熟蟲體也有一定作用。內(nèi)服吸收快,廣泛分布于各組織中。豬、羊、牛給藥后2~7h達(dá)血藥峰濃度。在體內(nèi)迅速代謝成5-羥噻苯達(dá)唑(5-OH-TBZ)

6犢牛用藥后,腎中藥物濃度最高,但肝的滯留期比腎長;噻苯達(dá)唑、5-羥噻苯達(dá)唑在肝和腎中的殘留量分別為57μg/kg、581μg/kg和153μg/kg、19μg/kg；休藥6天只有肝中有5-羥噻苯達(dá)唑殘留量(63μg/kg)；噻苯達(dá)唑在肌肉和脂肪中未被檢出，但5-羥噻苯達(dá)唑在用藥后1日內(nèi)可檢出,其殘留量分別為肌肉54μg/kg、脂肪64μg/kg。奶牛用藥后12h,噻苯達(dá)唑、5-羥噻苯達(dá)唑在奶中的殘留量分別為5007μg/kg和168μg/kg，84h時(shí)分別為20μg/kg和25μg/kg。

72、坎苯達(dá)唑(Cambendazole,CAM)別名噻苯達(dá)唑酯,為廣譜驅(qū)蟲藥。對動(dòng)物腸道寄生蟲和肺蠕蟲有明顯作用。制劑有混懸劑、糊劑或飼料粉的形式。內(nèi)服后在體內(nèi)迅速代謝,原藥和代謝物主要經(jīng)膽汁排泄,尿中占給藥量的25%,其中原形的不足5%。牛內(nèi)服后30日內(nèi),肝中可檢出殘留物,其中一部分為結(jié)合態(tài)。坎苯達(dá)唑有致畸性,因此休藥期要求適當(dāng)?shù)难娱L。牛休藥期21天,羊休藥期28天。

83、苯硫脲酯(Thiophanate)別名硫菌靈、硫苯尿酯,屬苯并咪唑的前體藥物,即在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)變成苯并咪唑氨基甲酸甲酯而發(fā)揮驅(qū)蟲作用。本品為微黃棕色結(jié)晶性粉末,在水、甲醇、乙酸乙酯和丙酮中微溶,在環(huán)己酮中易溶。動(dòng)物制劑有混懸劑和丸劑兩種,或用作飼料添加劑。廣譜驅(qū)蟲藥,對大多數(shù)動(dòng)物的胃腸線蟲成蟲及幼蟲均有良好效果。內(nèi)服吸收快而完全,8h達(dá)血藥峰濃度。用藥后24h,幾乎能從所有組織器官中(特別是肝、腎)測出藥物。用藥后72h內(nèi),大部分藥量經(jīng)糞和尿排出體外。

9畜禽用藥后,殘留量在肝和腎中較高,而其他可食組織中相對較低。綿羊一次內(nèi)服100mg/kg后休藥1日,肝、腎、肌肉和脂肪中的殘留量分別為930μg/kg、1060μg/kg、670μg/kg和2930μg/kg;休藥3日后均低于100μg/kg。犢牛一次內(nèi)服100mg/kg后休藥7日,肝、腎和肌肉中的殘留量均低于200μg/kg。豬一次內(nèi)服75mg/kg后休藥1日,肝、腎、肌肉和皮/脂肪中的平均殘留量分別為5550μg/kg、6600μg/kg、2600μg/kg和16200μg/kg;休藥3日分別為180μg/kg、100μg/kg、<100μg/kg和250μg/kg;休藥7日組織中殘留均低于100μg/kg。奶牛一次內(nèi)服100mg/kg后休藥6h、20h和30h,奶中殘留量分別為440μg/kg、320μg/kg和140μg/kg;休藥44h奶中未檢出殘留量(方法檢測限50μg/kg)。

104、非班太爾(Febantel,FEB)別名苯硫氨酯,為無色粉末,在丙酮、氯仿、四氫呋喃和二氯甲烷中溶解,在水和乙醇中不溶。非班太爾(FEB,屬苯并咪唑類前體藥物,內(nèi)服后在胃腸道內(nèi)迅速代謝為芬苯達(dá)唑(FBZ)及其砜類化合物(FBZ-SO和FBZ-SO2),FBZ-SO又稱奧芬達(dá)唑(OFZ),原藥在體內(nèi)濃度很低。代謝物的驅(qū)蟲活性比母藥非班太爾要強(qiáng)得多,而發(fā)揮有效的驅(qū)蟲效果。非班太爾在美國已批準(zhǔn)用于各種動(dòng)物的驅(qū)線蟲藥,以復(fù)方制劑上市,如用于犬、貓的產(chǎn)品多與吡喹酮等配合,以擴(kuò)太驅(qū)蟲范圍。

11牛內(nèi)服后18h,肝中約占總殘留量的90%,其中芬苯達(dá)唑30%~41%,奧芬達(dá)唑4%~19%,奧芬達(dá)唑砜14%~15%,非班太爾3%~6%,以及一些微量的氨基代謝物。休藥10日,肝中殘留量下降很多,其中以結(jié)合態(tài)的約占75%。鼠、羊、牛和豬內(nèi)服后,組織中的殘留量依次為肝>腎>脂肪>肌肉。

125、芬苯達(dá)唑(Fenbendazole,FBZ)別名硫苯達(dá)唑、苯硫達(dá)唑，無臭無味，在二甲基亞砜中溶解，在甲醇中微溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。為廣譜、高效、低毒的新型苯并咪唑類驅(qū)蟲藥。它不僅對動(dòng)物胃腸道線蟲成蟲、幼蟲有高度驅(qū)蟲活性,而且對網(wǎng)尾線蟲、矛形雙腔吸蟲、片形吸蟲和絳蟲亦有較佳效果。芬苯達(dá)唑在國外,不僅用于各種動(dòng)物,甚至還有野生動(dòng)物的專用制劑。由于芬苯達(dá)唑溶解度較低,因而給動(dòng)物內(nèi)服時(shí)吸收極少,如給綿羊、牛、豬內(nèi)服因吸收少,經(jīng)糞便排泄的原形藥約占44%~50%,而經(jīng)尿排泄的不足1%。

13吸收后芬苯達(dá)唑在動(dòng)物體內(nèi)迅速代謝為芬苯達(dá)唑亞砜(FBZ-SO)即奧芬達(dá)唑(OFZ)、芬苯達(dá)唑砜(FBZ-SO2)、芬苯達(dá)唑-2-氨砜(FEB-NH2-SO2)和一些少量的其他代謝物。原藥和代謝物主要經(jīng)膽汁排泄。在綿羊體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,由膽汁分泌后可再經(jīng)肝腸循環(huán)。豬用藥5mg/kg后休藥7天,肝中母藥殘留量為0.28mg/kg,其他無組織殘留。

14牛用藥10mg/kg后休藥2天,肝、腎、肌肉和脂肪中的母藥殘留量分別為8.4mg/kg、1.04mg/kg、0.47mg/kg和0.95mg/kg;休藥7天,只在肝中能檢測到殘留量0.67mg/kg。奶牛內(nèi)服10mg/kg后,12~24h奶中芬苯達(dá)唑濃度達(dá)峰值,休藥7天降至100μg/kg;12h芬苯達(dá)唑亞砜濃度達(dá)峰值,然后迅速下降,96h時(shí)未檢出;48h芬苯達(dá)唑砜濃度達(dá)峰值,96h時(shí)未檢出。鱒魚內(nèi)服后,在體內(nèi)部分代謝為奧芬達(dá)唑,并蓄積于魚皮中。母藥和奧芬達(dá)唑的消除期分別為96h和24h。芬苯達(dá)唑砜代謝物在魚體內(nèi)幾乎沒有。

156、奧芬達(dá)唑(OxfendazoIe,OFZ)別名磺唑氨酯,為白色或類白色粉末,有輕微的特殊氣味,在甲醇、丙酮、氯仿、乙醚中微溶,在水中不溶。奧芬達(dá)唑?yàn)榉冶竭_(dá)唑的衍生物,屬廣譜、高效、低毒的新型抗蠕蟲藥,其驅(qū)蟲譜大致與芬苯達(dá)唑相同,但驅(qū)蟲活性更強(qiáng)。奧芬達(dá)唑與阿苯達(dá)唑同為苯并咪唑類中,屬內(nèi)服吸收量較多的驅(qū)蟲藥。但反芻獸吸收量明顯低于單胃動(dòng)物,而且舍飼反芻獸比放牧?xí)r吸收量多。牛用藥后10~18天,牛肝中殘留量從55.5μg/kg降低至10μg/kg。羊用藥后10~24天,羊肝中殘留量從476μg/kg降低至12μg/kg。奶牛內(nèi)服2.5mg/kg后1天,奶中的殘留量為最高(0.49mg/kg),休藥8日則降低至0.005mg/kg;在48~72h內(nèi)奶中主要代謝物為芬苯達(dá)唑砜。休藥期為牛11天、羊21天,產(chǎn)奶期禁用。

167、阿苯達(dá)唑(Albendazole,ABZ)別名丙硫苯咪唑、丙硫苯咪唑,為白色或類白色粉末,無臭,無味,在丙酮或氯仿中微溶,在乙醇中凡乎不溶,在水中不溶,在冰醋酸中溶解。高效廣譜驅(qū)蟲藥,系苯并咪唑類藥物中驅(qū)蟲譜較廣、殺蟲作用最強(qiáng)的一種,對各種線蟲、絳蟲均有高度活性,對蟲卵發(fā)育也有顯著抑制作用。因不溶于水,故在腸道內(nèi)吸收緩慢。

17原藥在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為阿苯達(dá)唑亞砜(ABZ-SO)、阿苯達(dá)唑砜(ABZ-SO2)和阿苯達(dá)唑-2-氨砜(ABZ-NH2-SO2),前者為殺蟲的活性成分。在體內(nèi)分布量依次為肝、腎和肌肉占內(nèi)服后血藥達(dá)峰時(shí)間為2~4h,并且持續(xù)15~24h。原藥與亞砜代謝物在血中的濃度極低,半衰期為8.5~10.5h。24h內(nèi)約85%的給藥量經(jīng)腎排出,13%隨糞排出。

18牛和羊殘留消除研究表明,用藥后數(shù)日內(nèi)組織中的代謝物濃度變化很大,剛開始時(shí)主要為亞砜代謝物,接著是砜類和氨砜類代謝物。用藥后在日內(nèi)牛肝和牛腎中的殘留物有95%為結(jié)合態(tài),但羊組織中結(jié)合態(tài)代謝物很少。奶牛內(nèi)服10mg/kg后,12h奶中亞砜代謝物殘留量達(dá)峰值,然后迅速下降,36h時(shí)未被檢出;24h砜類代謝物殘留量達(dá)峰值,但消除緩慢,需156h可排凈;氨砜代謝物在奶中的量很低,36h達(dá)峰值,消除期180h。其他代謝物在服后24h達(dá)峰值,48h時(shí)低于方法的檢測限,但消除期為156h。

198、甲苯達(dá)唑(Mebendazole,MBZ)別名甲苯咪唑,為白色、類白色或微黃色結(jié)晶性粉末,在甲酸中易溶,在冰醋酸中略溶,在丙酮或氯仿中極微溶解,在水中不溶。為廣譜驅(qū)蟲藥,不僅對動(dòng)物多種胃腸線蟲有高效,而且對某些絳蟲亦有良效,并且是為數(shù)不多治療旋毛蟲的良藥之一。甲苯達(dá)唑早在20世紀(jì)80年代已廣泛用于世界各國的醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)臨床。

20內(nèi)服后胃腸道吸收差(5%~10%),吸收后迅速分布于血漿、肝、肺等,血藥達(dá)峰時(shí)間為2~4h,半衰期2.5~5.5h。在動(dòng)物肝內(nèi)很少代謝,代謝物為極性很強(qiáng)的羥基(MBZ-OH)和氨基代謝物(MBZ-NH2)。在24~48h內(nèi)經(jīng)糞便排泄的原形藥物約占80%左右,經(jīng)尿排泄的約為5%~10%。吸收后藥物,僅有極少量以脫羧基衍生物形式排泄。

21二、組織中苯并咪唑殘留和限量苯并咪唑類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留物與藥物本身有關(guān)外,還與給藥途徑、靶組織和消除期有關(guān)。標(biāo)志殘留定義為母體藥物及其主要代謝產(chǎn)物的總和。阿苯達(dá)唑：ABZ用藥后,在停藥初期,殘留物主要為ABZ-SO和ABZ-SO2;而在較長的停藥期,主要?dú)埩粑餅锳BZ-NH2-SO2,因此標(biāo)志殘留為ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的總和,以ABZ計(jì)。對FEB、FBZ和OFZ,標(biāo)志殘留為FBZ、OFZ(FBZ-SO)，和FBZ-SO2的總和,以FBZ-SO2計(jì)。藥物消除研究表明,OFZ和FBZ-SO2是組織中最常見的殘留物。

22在蛋中,氟苯達(dá)唑FLU標(biāo)志殘留主要為母體藥物,而在鳥類和豬可食組織中標(biāo)志殘留為FLU和FLU-HMET,因此以FLU和FLU-HMET的總量來定義FLU的標(biāo)志殘留。甲苯達(dá)唑MBZ標(biāo)志殘留定義為MBZ、MBZ-OH和MBZ-NH2的總和,以MBZ計(jì)。殘留消除研究表明,MBZ-NH2和MBZ-OH是組織中最持久的殘留物,對最高殘留限量(MRL)的影響最大。噻苯達(dá)唑TBZ標(biāo)志殘留定義為TBZ和5-OH-TBZ的總和。在動(dòng)物可食組織中,TBZ的母體藥物是最常見的殘留物,但在牛奶中,5-OH-TBZ的硫酸酯結(jié)合物為主要?dú)埩簟?/p>

23三氯苯達(dá)唑TCB標(biāo)志殘留定義為TCB、TCB-SO和TCB-SO2的總和。TCB禁止用于泌乳期動(dòng)物,由于TCB-SO2消除時(shí)間長,因此它可以作為殘留監(jiān)測的目標(biāo)化合物。奧苯達(dá)唑OXI標(biāo)志殘留為母體藥物。其他苯并咪唑類藥物,如CAM、LUX、PAR和BEN,在歐盟禁止用于動(dòng)物源食品,因此歐盟未規(guī)定MRL值。部分苯并咪唑類藥物的標(biāo)志殘留和最高殘留限量(MRL)。

24部分苯并咪唑類藥物的標(biāo)志殘留和最高殘留限量(MRL)

25三、樣品處理苯并咪唑類分子含咪唑環(huán)結(jié)構(gòu),兩個(gè)氮原子具有酸堿兩性,在適當(dāng)?shù)膒H條件下,分子可以質(zhì)子化(pKa約5~6)或去質(zhì)子化(pKa約12)。在酸性或堿性條件下,大部分苯并咪唑類藥物可解離,易溶于水性溶劑,并被提取,然后調(diào)節(jié)pH值使呈中性,用乙酸乙酯抽提。由于5-OH-TBZ在pH值范圍內(nèi)都能電離,易溶于酸性或堿性的水溶液,乙酸乙酯很難將其抽提出來。

26對于CAM、TCB和TCB代謝產(chǎn)物,它們都有兩個(gè)或更多的pKa,因此溶劑提取時(shí),控制溶液的pH值尤為重要。三氯苯達(dá)唑(TCB)、三氯苯達(dá)唑硫化物(TCB-SO)、TCB-SO2和CAM分別在pH7.3~10.9、5.0~9.0、3.8~8.0和7.4~11.1呈中性,因此,只有當(dāng)pH7.4~8.0時(shí),所有這些分子都呈中性。大部分苯并咪唑類藥物在pH8時(shí)都呈中性,當(dāng)預(yù)測某些苯并咪唑類藥物的pKa約為8時(shí),這時(shí)欲對這些組分同時(shí)提取變得相當(dāng)困難。但也有例外,如MBZ-NO2和OXI在pH>8.6和8.3,以非電離形式存在。

271、水解肝和奶樣中苯并咪唑類藥物與蛋白結(jié)合率較高,不易被有機(jī)溶劑提取,可先將樣品水解后再提取游離的藥物。常用的水解方法有酸水解和酶水解兩種。酸水解通常使用無機(jī)酸,例如用4moL/L鹽酸于80~110℃,在1~4h即可完成水解。酸水解具有簡便、快速、水解完全等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛采用。

28酶水解酶水解通常使用β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專一地水解葡萄糖醛酸苷結(jié)合物,后者可水解硫酸酯結(jié)合物。由于肝樣中通常存在上述兩種結(jié)合物,常使用β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.5~7.0,于一定溫度下孵育18~72h。與酸水解相比,酶水解比較溫和,一般不會(huì)引起藥物的分解,但有時(shí)水解不完全和實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高是該法的缺點(diǎn)。

29Tocco等發(fā)現(xiàn)TBZ在尿和奶中的代謝產(chǎn)物主要是5-OH-TBZ與葡糖苷酸和硫酸酯結(jié)合物,結(jié)合物用β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸(6mol/L鹽酸回餾1h)水解,釋放出游離的5-OH-TBZ。Chuckwudebe等對TBZ在蛋雞和奶牛中代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)結(jié)合物主要是硫酸酯結(jié)合物。Markus等對肝樣中的ABZ及其相關(guān)代謝物的結(jié)合物用酸解方法進(jìn)行水解,釋放出游離的ABZ-NH2-SO2。Coulet等對組織中的TBZ蛋白結(jié)合物用堿解方法水解。

302、提取及凈化液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑類藥物的最常用方法,通常將水性溶液調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)膒H值,用水不相溶的有機(jī)溶劑提取。用酸溶液提取時(shí),即包括了樣品的水解過程。由于苯并咪唑類藥物的極性和pKa差異很大,因此多殘留提取相當(dāng)困難,即使對單一藥物,母藥及其代謝產(chǎn)物的同時(shí)提取亦難。

31例如MBZ及其兩個(gè)代謝產(chǎn)物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈堿性,pKa分別是3.5和5.5,在pH>7.5時(shí),這兩種化合物不被電離;MBZ-OH含酸性的-OH,其pKa為9.8,在pH<7.8時(shí)不被電離。因此,溶液只有在pH7.5~7.8間,所有化合物不被電離,呈中性,這時(shí)可用極性溶劑(如:乙腈、甲醇、水-乙腈、水-甲醇等)來提取。

32(1)血漿、血清或其他生物液體生物體液樣品中的苯并咪唑類可用有機(jī)溶劑提取,直接進(jìn)樣分析。Bogan等將血漿樣品調(diào)節(jié)至pH7.4,用乙酸乙酯來提取FBZ、OFZ和ABZ。Hoaksey等將血漿樣品用乙腈脫蛋白,再用二氯甲烷提取ABZ和ABZ-SO。Alvinerie用乙酸乙酯提取血漿中TCB、TCB-SO和TCB-SO2,以及TBZ和5-OH-TBZ,直接用HPLC-UV測定。

33THANKYOUSUCCESS2022/10/1934可編輯

34Allan等將血漿樣品用酸性溶液稀釋后過C18小柱,依次用20mL水、0.5mL甲醇+水(40+50)和0.4mL甲醇淋洗,最后用1.6mL甲醇洗脫,甲苯達(dá)唑及其代謝物的回收率大于80%。Hennessy等將這一方法用于膽汁中TCB的提取,但樣品過柱前先用乙酸乙酯提取,后來也用于血漿樣品中ABZ的提取。自動(dòng)萃取儀具有省時(shí)、省力、重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用日趨廣泛。Rouan等采用自動(dòng)萃取儀、C18固相萃取柱提取/凈化血漿樣品中TCB,回收率可達(dá)到90%以上。

35(2)組織動(dòng)物組織中的苯并咪唑類提取一般用有機(jī)溶劑,并經(jīng)LLP和SPE凈化。有人采用LLP和SPE相結(jié)合方法進(jìn)行凈化,用HPLC-UV檢測。也有人采用LLP的單一凈化方法,用選擇性高的熒光檢測或LC-MS/MS檢測。雖然LLP凈化方法選擇性較差,但適合于苯并咪唑類的多組分提取,而用復(fù)雜的凈化方法可能回收率較低。

36Brandon等用二甲亞砜-水(10+90)來提取肝組織中的TBZ,在ELISA測定前用PBS稀釋。Brandon等采用類似的方法,用二甲亞砜-水(10+90)提取肝組織中11種苯并咪唑類殘留,包括水溶性低的FBZ。Marti等用乙腈提取肌肉、肝臟、腎臟組織中8種苯并咪唑類殘留,提取物用LLP凈化,包括正己烷、飽和氯化鈉和二氯甲烷洗滌,然后用C18固相萃取柱濃縮/凈化,再用HPLC-UV或GC-MS分析,除OFZ外,回收率均在65%以上,OFZ在肝臟和腎臟中的回收率僅為45%和39%。

37Farrington等用乙酸乙酯提取肝組織中5種苯并咪唑類殘留,并用酸性氧化鋁和C18柱凈化,HPLC-UV分離測定,回收率在73%~90%。Blanchflower等用甲醇-水(20+7)提取肝和肌肉組織中FBZ和OFZ,提取液用石油醚洗滌,經(jīng)磷酸鹽緩沖液稀釋后,再用乙醚-乙酸乙酯(60+40)洗滌,FBZ和OFZ的回收率大于80%和70%。Wilson等用乙酸乙酯提取肌肉和肝組織中8種苯并咪唑類殘留。Wilson方法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織中苯并咪唑類殘留的提取/凈化。

38Hajee等對鰻魚肉的均質(zhì)液用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至pH7.5,發(fā)現(xiàn)只有在pH7.5~7.8之間,所有的MBZ標(biāo)志殘留物(MBZ、MBZ-OH、MBZ-NH2)呈中性,能被乙酸乙酯提取;在SPE凈化中分別采用正相和反相柱,發(fā)現(xiàn)氨基丙基柱較合適;在過氨基丙基柱前,先用正己烷調(diào)節(jié)乙酸乙酯提取液的極性,上樣后,氨基丙基柱用異辛烷淋洗,再用甲醇洗脫;MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分別為80%、60%和85%。Cannavan等用乙酸乙酯提取肝、腎和肌肉組織均質(zhì)液(調(diào)節(jié)至pH7.0)中TBZ和5-OH-TBZ,過氰丙基(CN)SPE柱,TBZ和5-OH-TBZ的回收率分別為96%~103%和70%~85%,若采用氘化TBZ作為內(nèi)標(biāo)物,可提高5-OH-TBZ回收率的重現(xiàn)性。

39Capece等在pH8.0條件下用乙酸乙酯提取肌肉、脂肪和腎臟組織中的FBZ標(biāo)志殘留物,提取液直接HPLC分析。DeRuycke等在堿性條件下用乙酸乙酯提取雞蛋和肌肉組織中FLU、FLU-HMET和FLU-HMET,提取液蒸干,再用甲醇和正己烷進(jìn)行液-液分配凈化,LC-MS/MS分析,FLU標(biāo)志殘留物的回收率在70%(雞蛋)~87%(肌肉)之間。Edder等在堿性條件下從肝臟和肌肉中提取了11種苯并咪唑類藥物和左旋咪唑殘留,用MBC作為內(nèi)標(biāo),提取物經(jīng)甲醇和正己烷液-液分配凈化,回收率大于70%。等等

40(3)牛奶和奶制品奶制品相對于組織樣品要容易處理些,而且牛奶含更少的色素和內(nèi)源性干擾物。牛奶樣品一般要脫蛋白和脂肪預(yù)處理,再調(diào)節(jié)溶液pH值,用水不相溶的有機(jī)溶劑(如:乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷)來提取,pH值的選擇與被測物的種類和數(shù)量有關(guān)。

41例如Tocco等發(fā)現(xiàn)在pH6時(shí),用乙酸乙酯可提取牛奶中TBZ和5-OH-TBZ。Fletouris等發(fā)現(xiàn)在pH9.8時(shí),用乙酸乙酯提取牛奶中ABZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的效果最好,回收率分別為81%、78%和100%。后來他們在pH10時(shí),用乙酸乙酯提取牛奶中10種苯并咪唑類殘留,比較了不同的pH值(3~11.5)對提取效率的影響,發(fā)現(xiàn)pH10時(shí)大多數(shù)苯并咪唑類藥物的回收率較高,平均回收率為79%~100%,FBZ的回收率為56%~66%。Flotouris等還試驗(yàn)了在pH2~9條件下用乙腈提取,FBZ的回收率接近100%,表明用乙腈提取時(shí),pH值的變化對提取效率影響不大。

42牛奶中多殘留分析的提取和凈化方法

43三、分析方法苯并咪唑類藥物殘留的測定方法主要有生物檢測法、分光光度法、薄層色譜法、免疫分析法、氣相色譜法和液相色譜法，采用紫外、熒光和質(zhì)譜檢測。

441、生物檢測法生物檢測法曾被用來檢測食品中苯并咪唑類殘留,但現(xiàn)在大部分用來評價(jià)驅(qū)蟲劑的效能。生物檢測法首先用TLC板將殘留物分離出來,然后用含培養(yǎng)劑和生物指示劑的溶液噴霧TLC板,TLC板上抑制生物繁殖的區(qū)域表明藥物殘留的存在,抑制區(qū)域的大小與殘留物的濃度有關(guān)。

45Erwin等建立了一種檢測BEN的生物學(xué)方法；Peterson等建立了農(nóng)作物中BEN和MBC的生物檢測法,提取液通過硅膠TLC板分離BEN和MBC殘留物,隨后用瓊脂和青霉素芽孢混合液噴霧,室溫培養(yǎng)20h,生物檢測法的靈敏度比紫外分光光度法高出十倍左右。Dew等利用豬蛔蟲幼體對TBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和MBZ敏感性,建立了一種生物篩選法;生物檢測法作為檢測食品中苯并咪唑類殘留的篩選方法,具有成本低的優(yōu)點(diǎn),但生物體對苯并咪唑類藥物的敏感性差異很大,實(shí)際應(yīng)用中還需作進(jìn)一步的評估。

462、分光光度法采用分光光度法測定農(nóng)作物中的BEN殘留。Pease等先將BEN轉(zhuǎn)化為2-氨基苯并達(dá)唑(2-AB),然后用溴衍生化,再進(jìn)行熒光光度法(λex285nm,λem335nm)或紫外-可見分光光度法(445nm)測定,檢測限為100μg/kg。2-AB、TBZ和2-(2-呋喃)-苯并咪唑本身具有熒光,然而只有2-AB與溴反應(yīng)可產(chǎn)生有色衍生物。因此,溴化后通過紫外-可見分光光度法測定,可區(qū)別2-AB和其他苯并咪唑類藥物。Aharonson等采用柱層析法凈化農(nóng)作物中的BEN和TBZ殘留,再用熒光光度法測定。

47Baeyens等利用MBZ和FLU在堿性條件下與0.3%過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生熒光,檢測了制劑中藥物含量,這一方法也可用于四咪唑、右旋咪唑和左旋咪唑的檢測。

483、薄層色譜法TLC作為半定量分析方法,適合于食品中苯并咪唑類殘留檢測的篩選。Norman等采用TLC和熒光檢測法(λex302nm,λem360nm)測定柑橘類水果中的TBZ。White等采用TLC法檢測農(nóng)作物中MBC殘留,板上噴霧一層熒光指示劑,用氯仿-醋酸鹽-乙酸混合溶劑(190+10+4)展開,在254nm處紫外檢測,檢測限為50μg/kg。Corti等采用TCL法檢測馬鈴薯中TBZ和其他殘留物,樣液滴加在C8板上,用乙醇-水(10+3)展開,在248nm處紫外檢測,但這種方法的靈敏度比高效液相色譜法低。

49Corti等還采用TLC法還測定了水果中BEN、MBC和TBZ,以氯仿-環(huán)己胺-甲醇(6+1+01)作展開劑,在NH2-HPTLC板上將MBC和TBZ的殘留物分離出來,285nm處紫外檢測。Abjean等建立了TLC法檢測肝組織中ABZ-NH2-SO2的篩選方法,以乙腈-氫氧化銨(10+0.6)作展開劑,在涂有熒光指示劑的硅膠板上將ABZ-NH2-SO2分離出來,檢測限低于500μg/kg。

504、免疫分析法免疫分析法是一種簡便、靈敏、選擇性高的檢測方法。一般情況下,生物樣品如血漿、血清、牛奶能夠直接測定或者稀釋后測定。早期,放射免疫法被應(yīng)用于測定動(dòng)物組織和農(nóng)作物中的苯并咪唑類殘留。Nerenberg等建立了放射免疫法檢測血漿中的OFZ,多克隆抗體通過兔免疫接種OFZ和多聚賴氨酸載體培養(yǎng)得到,后來這種方法應(yīng)用于綿羊脂肪組織中OFZ殘留的檢測。Newsome等采用多克隆抗體、放射免疫法檢測農(nóng)作物中BEN及其主要代謝產(chǎn)物MBC,多克隆抗體通過兔接種半抗原-2-氨基苯并咪唑和人血清蛋白培養(yǎng)得到。

51ELISA檢測近來,ELISA被普遍應(yīng)用且大大超過了放射免疫檢測法。Brandon等建立了一種競爭性ELISA法檢測肝組織中的TBZ殘留,單克隆抗體通過鼠接種TBZ和5-OH-TBZ半抗原,在牛血清蛋白(BSA)中培養(yǎng)得到。他們發(fā)現(xiàn),用TBZ免疫得到的抗體對TBZ和5-OH-TBZ特異性高,而用5-OH-TBZ免疫得到的抗體特異性較差,對CAM和TBZ-NH2有交叉反應(yīng)。對不含噻唑環(huán)的苯并咪唑類藥物(如:ABZ、MBZ和FBZ),結(jié)果表明沒有明顯的交叉反應(yīng)。

52基于辣根過氧化物酶結(jié)合(HRP)的競爭性ELISA法已被用于肝組織提取液以及水果、蔬菜和果汁中TBZ的檢測,果汁樣品稀釋后可直接檢測。Brandon等研制出一種鼠單克隆抗體,通過鼠接種ABZ的琥珀酰胺半抗原和BSA載體制得的抗體,對11種苯并咪唑氨基甲酸酯有良好的交叉反應(yīng),包括ABZ、FBZ、OXI、MBZ、FLU、MBC和一些代謝產(chǎn)物,但對噻苯達(dá)唑類(TBZ、CAM和5-OH-TBZ)沒有交叉反應(yīng)。另外,他們還建立了一種基于辣根過氧化物酶結(jié)合的競爭性ELISA法,用來檢測牛肝提取液中的苯并咪唑殘留,后被用于牛奶中FBZ殘留的檢測;牛奶樣品測定前用PBS-Tween-BSA稀釋。

53Bushway等應(yīng)用ELISA試劑盒對加工或未加工的果蔬中TBZ殘留檢測進(jìn)行了評估,用BEN-MBC半抗原制得的多克隆抗體對TBZ有顯著交叉反應(yīng),可被用于食品中的檢測。Newsome等建立了ELISA法檢測農(nóng)作物中BEN和TBZ殘留,多克隆抗體通過兔免疫接種制得,抗原是由人血清蛋白和TBZ、MBC(BEN的降解產(chǎn)物)的琥珀酰胺半抗原相偶合得到。Crooks等研制出一種多克隆抗體,對8種苯并咪唑氨基甲酸酯類藥物有交叉反應(yīng)。以ABZ琥珀酰胺和HAS載體蛋白偶合物作為抗原,抗體通過羊免疫接種制得,建立了基于HRP的競爭性ELISA法檢測牛肝組織中的苯并咪唑類殘留。

545、氣相色譜法只有少數(shù)苯并咪唑類藥物(如:TBZ、5-OH-TBZ)可直接用GC法分析。Lafuente等采用硅酮鍵合相的毛細(xì)管柱(10m×0.53mm)分離水果中TBZ殘留物,分別用氮磷檢測器(NPD)和電子捕獲檢測器(ECD)檢測,發(fā)現(xiàn)NPD檢測的靈敏度更高,LOD為10μg/kg。Oishi等采用GC-NPD法檢測TBZ,石英毛細(xì)管柱(25m×0.2mm)分離,LOD為10μg/kg。大部分苯并咪唑類藥物極性較高,難以氣化,熱穩(wěn)定性差,故GC法分析需要衍生化。

55衍生化由于苯并咪唑類分子結(jié)構(gòu)上含氨基和羥基,可與衍生劑發(fā)生?；?、硅烷化和烷基化反應(yīng)。常用的?；苌鷦┯腥宜狒?TFA)、七氟丁酸酐(HFB)和五氟芐基酰氯(PFB-CO-Cl);硅烷化試劑有N,O-雙三甲硅基乙酰胺(BSA)、N-甲基-N-(叔丁基二甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)和N-甲基-(三氟乙酰胺)(MBTFA);烷基化衍生劑有碘甲烷、溴代五氟苯、五氟芐基溴(PFB-Br)、二甲基乙縮醛-二甲基甲酰胺(DMA-DMF)和氫氧化三甲基苯胺(TMAH)。

56另外也可以將氨基甲酸酯官能團(tuán)水解后形成氨基,再進(jìn)行?；?、硅烷化和烷基化反應(yīng)。衍生物經(jīng)GC分離后,可采用電子捕獲檢測、氮磷檢測和質(zhì)譜(MS)檢測。Jacob等用N,O-雙三甲硅基乙酰胺衍生化GC-MS法,測定了TBZ殘留物的光分解產(chǎn)物,后來用相同的方法證實(shí)了尿中CAM代謝物的結(jié)構(gòu)式。VandenHeuvel等建立了柱上甲基化衍生、GC-MS法測定CAM殘留物,進(jìn)樣前殘留物溶解于0.125mol/L的三乙基氫氧化銨的甲醇溶液中。

57Tanaka等用GC-FID法測定TBZ的甲基衍生物,衍生化是通過在乙腈中二甲基甲酰胺和二甲基乙縮醛反應(yīng)(120℃、40min),該方法可檢測出水果中TBZ殘留量100μg/kg。Physalo等將BEN通過乙酸酐衍生化(100℃、30min),毛細(xì)管GC-NPD測定,檢測限10μg/kg,但采用GC-ECD檢測,靈敏度約降低10倍。Bardalaye等對Physalo的方法作了改進(jìn),用來檢測水果中的TBZ殘留。Markus等建立了衍生化GC-MS-EI法測定組織中的ABZ-NH2-SO2殘留。Balizs等用PFB-Br衍生化,毛細(xì)管GC-高分辨質(zhì)譜法(HRMS)測定組織中的TBZ和ABZ殘留。

586、液相色譜法HPLC法被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織中苯并咪唑類殘留的分析,通常采用反相柱如C18、C8柱分離,也有采用正相柱如uBondapakNH2柱分離。存在問題：采用硅膠基質(zhì)的RP-HPLC法測定苯并咪唑類時(shí),硅膠鍵合相表面殘余的帶負(fù)電荷硅醇基能強(qiáng)烈吸附苯并咪唑類藥物,導(dǎo)致保留時(shí)間過長、峰拖尾或變形。當(dāng)流動(dòng)相在弱酸性或中性時(shí)(pH5~7),苯并咪唑類的離子化被抑制,最后出峰的組分保留時(shí)間較長,峰展寬嚴(yán)重;當(dāng)流動(dòng)相為酸性時(shí)(pH2~3),苯并咪唑類的離子化增強(qiáng),先出峰的組分容易分離,但后出峰的組分拖尾嚴(yán)重。

59解決辦法：為降低游離硅醇基的吸附作用和增加苯并咪唑類藥物在流動(dòng)相中的溶解性,可采取離子抑制或離子增強(qiáng)的方法來解決。通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值、加入離子對試劑、掩蔽劑、鹽和較高比例的有機(jī)改性劑等,對流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化。例如,在酸性流動(dòng)相中加入四丁基銨陽離子,可改善苯并咪唑類的色譜性能,消除峰變形,提高分辨率。

60早期,分離柱有采用硅膠柱或陽離子交換柱。Karlaganis等用硅膠柱分離血漿中的BNZ,以乙腈-氯仿飽和水溶液-甲酸(75+92.5+0.25)作流動(dòng)相。Alvinerie等用硅膠柱分離TCB、TCB-SO、TCB-SO2和OFZ,在15min內(nèi)獲得良好的分離。Kirkland等用陽離子交換柱分離植物和土壤中的BEN殘留。Arenas等用強(qiáng)陽離子交換柱分離牛奶中的TBZ和5-OH-TBZ。

61Bogan等最早采用C18柱分離8種苯并咪唑類殘留,分析時(shí)間14min,但分離度較差。Long等和Wilson等分別建立了多殘留RP-HPLC法分離8種苯并咪唑類藥物,分析時(shí)間為35min,采用梯度洗脫,可改善分離度。Rose用C8柱、二元泵梯度洗脫,35min內(nèi)分離OFZ和9種代謝產(chǎn)物。Roudaut等用C18柱,二元泵梯度洗脫,分離了10種苯并咪唑類殘留,除OXI和OFZ外,所有殘留物在16min內(nèi)獲得分離。

62Negro等采用離子對色譜法分離血漿和尿中TCB-SO和TCB-SO2,考察了影響色譜性能的實(shí)驗(yàn)參數(shù),如溶液pH、有機(jī)改性劑含量、離子對試劑(烷基磺酸鈉)的烷基鏈長,結(jié)果表明,最適宜的流動(dòng)相為0.05mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)-乙腈(55+45)含0.001mol/L癸烷磺酸鈉。DeRuyck等建立了離子對色譜法分離FBZ、TBZ、ABZ、OXI和LEV殘留的方法,采用梯度洗脫,辛烷磺酸鈉作為離子對試劑,用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH3.5。

63檢測器苯并咪唑類及其代謝物在245nm和295nm處有強(qiáng)的吸收,可用紫外檢測。在295nm處摩爾吸收系數(shù)相對較低(>10000),但干擾少,吸收峰穩(wěn)定、靈敏度足夠,應(yīng)用較多。對于本身有熒光的化合物,如阿苯達(dá)唑及其代謝物和噻苯達(dá)唑及其代謝物,可用熒光檢測,內(nèi)源性雜質(zhì)干擾小、檢測靈敏度高。光電二極管陣列檢測(PDA)可提供化合物的吸收光譜圖(200~700nm),與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖進(jìn)行對照,可對樣品作出初步的定性判斷。

64PDA檢測器價(jià)格低廉、應(yīng)用廣,但在專一性和靈敏度上欠高,特別在檢測動(dòng)物組織中痕量的藥物殘留時(shí)有一定局限性。質(zhì)譜檢測(MS)特別是串聯(lián)質(zhì)譜檢測(MS/MS)作為通用型檢測器,具有高靈敏和高選擇性的優(yōu)點(diǎn),能提供化合物的結(jié)構(gòu)信息,予以定性確證,在殘留分析中的應(yīng)用日趨廣泛。LC-MS通常采用短柱((150mm)分離,色譜柱平衡時(shí)間短,適合樣品的高通量分析。

65Blanchflower等采用LC-MS法測定FBZ和OFZ殘留,發(fā)現(xiàn)等度洗脫比梯度洗脫重復(fù)性好。Cannavan等采用梯度洗脫來分離TBZ和5-OH-TBZ,流動(dòng)相由乙腈和0.1mol/L醋酸銨組成。Balizs建立了15種苯并咪唑殘留測定的LC-MS/MS方法,采用細(xì)直徑柱(2.1mm)分離,流動(dòng)相流速為0.04~0.2mL/min,苯并咪唑類藥物在6min內(nèi)出峰,但沒有達(dá)到完全分離。DeRuycke等建立了LC-MS/MS法測定蛋和肌肉組織中苯并咪唑殘留,包括FLU、FLU-HMET和FLU-RMET。后來,他們還檢測了牛奶中左旋咪唑和7種苯并咪唑類藥物的殘留。

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