T∕GDSF 0010-2022 南海島礁海域石斑魚資源養(yǎng)護(hù)技術(shù)規(guī)范.pdf

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ICS65.150CCSB50GDSF廣東水產(chǎn)學(xué)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/GDSF0010—2022南海島礁海域石斑魚資源養(yǎng)護(hù)技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationsforresourceconservationofreef-inhabitinggroupersintheSouthChinaSea2022-11-30發(fā)布2022-12-1實(shí)施廣東水產(chǎn)學(xué)會發(fā)布 T/GDSF0010—2022目次前言...........................................................................II1范圍................................................................................12規(guī)范性引用文件......................................................................13術(shù)語和定義..........................................................................14海域選擇............................................................................15生物量調(diào)查與評估....................................................................26養(yǎng)護(hù)方法............................................................................2魚種選擇........................................................................2親魚的投放......................................................................2石斑魚苗種的投放................................................................27監(jiān)測方法............................................................................2水環(huán)境調(diào)查......................................................................2漁業(yè)資源調(diào)查....................................................................2環(huán)境DNA調(diào)查....................................................................28效果評估............................................................................2環(huán)境要素........................................................................3生物要素........................................................................3生態(tài)壓力........................................................................3漁業(yè)生產(chǎn)要素....................................................................39管理................................................................................3附錄A（資料性）環(huán)境DNA的調(diào)查方法..............................................4A.1抽樣............................................................................4A.2運(yùn)輸............................................................................4A.3保藏............................................................................4A.4DNA提取.........................................................................4A.5魚類物種鑒定條形碼（12SrRNA基因；163bp～185bp)分析............................4I T/GDSF0010—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由廣東水產(chǎn)學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位：中國科學(xué)院南海海洋研究所、中山大學(xué)、廣東海洋大學(xué)、海南大學(xué)、廣西科學(xué)院、廣西精工海洋科技有限公司、湛江市東海島東方實(shí)業(yè)有限公司。本文件主要起草人：胡超群、夏軍紅、王學(xué)鋒、李廣麗、周永燦、陳廷、吳小易、李文笙、孫彩云、陳償、羅鵬、柯志新、田昌緒、李建龍、姜發(fā)軍、朱宗賢、宋建強(qiáng)、陳文林。II T/GDSF0010—2022南海島礁海域石斑魚資源養(yǎng)護(hù)技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了南海島礁海域石斑魚資源養(yǎng)護(hù)的海域選擇和資源調(diào)查與評估要求，描述了資源養(yǎng)護(hù)、監(jiān)測與效果評估的方法，提供了石斑魚資源養(yǎng)護(hù)管理的指導(dǎo)意見。本文件適用于南海島礁海域石斑魚的資源養(yǎng)護(hù)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T12763.9海洋調(diào)查規(guī)范第9部分：海洋生態(tài)調(diào)查指南SC/T9401.6水生生物增殖放流技術(shù)規(guī)程第6部分：放流物種質(zhì)量SC/T9401.7水生生物增殖放流技術(shù)規(guī)程第7部分：檢驗(yàn)SC/T9401.11水生生物增殖放流技術(shù)規(guī)程第11部分：投放SC/T9403.5海洋漁業(yè)資源調(diào)查規(guī)范第5部分：海洋漁業(yè)資源調(diào)查SC/T9405.5島礁水域生物資源調(diào)查評估技術(shù)規(guī)范第5部分：礁棲性魚類資源調(diào)查SC/T9405.7島礁水域生物資源調(diào)查評估技術(shù)規(guī)范第7部分：漁業(yè)生產(chǎn)調(diào)查SC/T9417.4人工魚礁資源養(yǎng)護(hù)效果評價(jià)技術(shù)規(guī)范第4部分：調(diào)查SC/T9417.5人工魚礁資源養(yǎng)護(hù)效果評價(jià)技術(shù)規(guī)范第5部分：評估3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。礁棲石斑魚Reef-inhabitinggroupers自然棲息于珊瑚礁或巖礁海域的石斑魚亞科魚類。生物資源養(yǎng)護(hù)Biologicalresourceconservation通過修復(fù)和改善生物的棲息地環(huán)境，對資源受損的某種或多個(gè)物種進(jìn)行種群重建，增加生物多樣性和增強(qiáng)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以保護(hù)和恢復(fù)生物資源。石斑魚生物量Grouperbiomass棲息于某一島礁海域的石斑魚數(shù)量或重量。環(huán)境DNAEnvironmentalDNA是指從環(huán)境樣本中提取的所有DNA的集合，包括環(huán)境微生物以及從生物體上脫落下來的活細(xì)胞DNA和因生物死亡后細(xì)胞破碎而游離出的胞外DNA。4海域選擇根據(jù)島礁環(huán)境特點(diǎn)，結(jié)合歷史資料、捕撈生產(chǎn)信息以及資源生態(tài)環(huán)境的本底調(diào)查資料，針對不同種類的石斑魚，選擇合適的資源養(yǎng)護(hù)海域。養(yǎng)護(hù)海域應(yīng)符合SC/T9401.4的規(guī)定，且滿足下述條件：島礁為天然珊瑚礁或巖礁，水流較緩且附近底質(zhì)起伏而又多石礫；水深1m～100m，溶氧量≥5mg/L，鹽度10～36。1 T/GDSF0010—20225生物量調(diào)查與評估按照SC/T9405.5規(guī)定的方法對養(yǎng)護(hù)海域的石斑魚生物量進(jìn)行調(diào)查和評估。6養(yǎng)護(hù)方法魚種選擇根據(jù)目標(biāo)海域功能定位和海域環(huán)境，選擇目標(biāo)海區(qū)及其周邊海區(qū)現(xiàn)有或歷史上存在的石斑魚種類為養(yǎng)護(hù)目標(biāo)種類。南海島礁海域可選擇棕點(diǎn)石斑魚（Epinephelusfuscoguttatus）、斜帶石斑魚（E.coioides）和豹紋鰓棘鱸（Plectropomusleopardus）為目標(biāo)種類。親魚的投放6.2.1親魚來源要求應(yīng)捕自天然海區(qū)或是原種場保種的石斑魚原生種。6.2.2親魚質(zhì)量要求按照SC/T9401.7規(guī)定的方法對親魚進(jìn)行檢疫，除滿足不攜帶病原的條件之外，還需達(dá)到以下要求：a)體色正常、體格健壯、無外傷、無畸形；b)性腺發(fā)育良好、雌性親魚腹部膨大且柔軟，輕壓雄性親魚腹部能流出乳白色精液；c)反應(yīng)靈敏、活力好。6.2.3親魚投放方法按照SC/T9401.11規(guī)定的方法在島礁海域進(jìn)行親魚投放。石斑魚苗種的投放6.3.1苗種來源要求培育苗種的親魚應(yīng)捕自天然海區(qū)或是原種場保育的原生種，不使用近親繁殖親魚的后代。6.3.2苗種質(zhì)量評價(jià)按照SC/T9401.6和SC/T9401.7規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，評價(jià)苗種質(zhì)量。6.3.3苗種投放方法按照SC/T9401.11規(guī)定的方法進(jìn)行石斑魚苗種投放。7監(jiān)測方法水環(huán)境調(diào)查按照SC/T9417.4規(guī)定的方法對養(yǎng)護(hù)海域的水環(huán)境進(jìn)行調(diào)查，包括水文、水體化學(xué)和表層沉積物。漁業(yè)資源調(diào)查按照SC/T9403.5和SC/T9405.5規(guī)定的方法和要求，對養(yǎng)護(hù)海域石斑魚資源進(jìn)行調(diào)查和樣品采集，調(diào)查內(nèi)容包括種類組成、數(shù)量、群體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征。環(huán)境DNA調(diào)查參照附錄A的環(huán)境DNA調(diào)查方法對放流海域的環(huán)境DNA樣品進(jìn)行分析，鑒定放流海域存在的石斑魚種類和相對豐度，進(jìn)而評價(jià)石斑魚的資源養(yǎng)護(hù)效果。8效果評估2 T/GDSF0010—2022評估內(nèi)容主要包括：環(huán)境要素、生物要素、生態(tài)壓力和漁業(yè)生產(chǎn)要素。環(huán)境要素包括水文和水體化學(xué)，按照SC/T9417.5規(guī)定的方法和內(nèi)容進(jìn)行調(diào)查和評估。生物要素包括物種生物多樣性和豐度，對SC/T9417.5中表2所列的生物要素進(jìn)行評估。生態(tài)壓力按照GB/T12763.9規(guī)定的相關(guān)方法進(jìn)行評估。漁業(yè)生產(chǎn)要素按照SC/T9405.7規(guī)定的方法進(jìn)行調(diào)查和評估。9管理應(yīng)定期巡查石斑魚資源養(yǎng)護(hù)海域，防止非法捕撈養(yǎng)護(hù)的石斑魚資源。在條件許可海區(qū)設(shè)立石斑魚自然保護(hù)區(qū)，明確保護(hù)區(qū)的功能、保護(hù)對象及管理目標(biāo)。3 T/GDSF0010—2022附錄A（資料性）環(huán)境DNA的調(diào)查方法A.1抽樣按照GB/T18654.2規(guī)定的抽樣方法執(zhí)行。島礁海域每個(gè)區(qū)域至少設(shè)置三個(gè)取樣點(diǎn)，在每個(gè)取樣點(diǎn)貼近海底沉積物處取1L海水，重復(fù)取樣三次，1L去離子水作為對照。A.2運(yùn)輸樣品在運(yùn)輸過程中，輔以干冰或冰塊，將容器內(nèi)的溫度控制在25℃以內(nèi)。A.3保藏樣品運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，采用醋酸纖維素過濾膜（孔徑0.22μm）進(jìn)行過濾。過濾后的濾紙可以裝進(jìn)試管，保存于-80℃，直至DNA抽提。A.4DNA提取按照常規(guī)酚-氯仿或試劑盒DNA提取方法提取總DNA。DNA放入-70℃或-20℃低溫冰箱長期保存。A.5魚類物種鑒定條形碼（12SrRNA基因；163bp～185bp)分析A.5.1PCR引物A.5.1.1第1輪PCR擴(kuò)增魚類通用引物序列（Miya,etal.,2015)MiFish-U-F：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’MiFish-U-R：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’在上述兩條引物中，前面的33個(gè)和34個(gè)核苷酸（nt）部分為高通量測序引物的結(jié)合位點(diǎn)，隨后的6個(gè)隨機(jī)引物（NNNNNN，如AAGGTT）用于增強(qiáng)測序平臺流動池（flowcell）DNA簇的分離，最后的21個(gè)和25個(gè)堿基序列為12SrRNA基因通用引物序列。A.5.1.2第2輪擴(kuò)增通用引物Forward：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’Reverse：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’在上述兩條引物中，8個(gè)連續(xù)X堿基代表Illumila測序技術(shù)通用的Index序列，可以用于區(qū)分不同樣本；連續(xù)X堿基前面的5’端序列允許擴(kuò)增產(chǎn)物與測序平臺流動池（flowcell）的寡核苷酸進(jìn)行特異結(jié)合，連續(xù)X堿基后面的3’端序列是Illumila測序引物結(jié)合位點(diǎn)。該引物組合為Illumila測序建庫專用引物，通過第二輪PCR擴(kuò)增獲得的序列文庫，割膠純化后可以直接送測序公司進(jìn)行高通量測序。A.5.2檢測內(nèi)容和主要方法A.5.2.1第一輪PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)在熱循環(huán)儀器（如Model9700）中進(jìn)行，PCR體系的反應(yīng)體積為12μL，其中包括4.6μL雙蒸水、6μL2×HiFiHotStartReadyMix、0.2μL正反向引物（10μM）和1.0μL總DNA模板（50ng）。PCR熱循環(huán)條件：95℃高溫預(yù)變性3min；95℃變性20s，65℃退火15s，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。A.5.2.2第二輪PCR擴(kuò)增4 T/GDSF0010—2022將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪PCR模板，PCR體系的反應(yīng)體積為12μL，包括6.0μL2×HiFiHotStartReadyMix、0.7μL正反向引物（5μM）、3.6μL雙蒸水和1.0μL模板。PCR熱循環(huán)條件：95℃預(yù)變性3min；98℃變性20s，65℃退火15s，72℃延伸15s；72℃再延伸5min。A.5.2.3PCR產(chǎn)物檢測利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。點(diǎn)樣5μL后，在120V恒壓下電泳25min。采用DNA凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增情況。目標(biāo)基因序列約為370bp。A.5.2.4測序切膠純化PCR產(chǎn)物，送測序服務(wù)公司進(jìn)行Illumila高通量測序。A.5.2.5石斑魚鑒定A.5.2.5.1序列聚類采用FastQC、Cutadapt、USEARCH等生物信息學(xué)軟件，對原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行分析并去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)。采用QIIME2分析軟件，在97%的序列相似水平下，對高質(zhì)量的eDNA測序序列數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，去除冗余序列，獲得所有序列的分類單元（OTU）。A.5.2.5.2物種注釋通過序列比對方法，將所有的分類單元數(shù)據(jù)與已知物種的核糖體RNA序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，從而獲得每個(gè)分類單元的物種注釋數(shù)據(jù)。A.5.2.5.3分類鑒定基于物種注釋數(shù)據(jù)，鑒定eDNA樣本中的石斑魚屬和種。A.5.2.6特定石斑魚相對豐度計(jì)算根據(jù)分類單元注釋數(shù)據(jù)中石斑魚種和屬的分類情況，分別統(tǒng)計(jì)石斑魚的屬序列條數(shù)（Gn）和種序列條數(shù)(Sn)及其占全部魚類序列條數(shù)(Tn)的百分比。A.5.2.6.1特定石斑魚屬的相對豐度為特定石斑魚屬序列條數(shù)占全部魚類序列條數(shù)的百分比，計(jì)算公式如下：?????=(????????????????)×100%·····························································(A.1)式中：Rg——特定石斑魚屬相對豐度，單位為%；Gn——特定石斑魚屬的序列條數(shù)，單位為條；Tn——全部魚類序列條數(shù)，單位為條。A.5.2.6.2特定石斑魚種的相對豐度為特定石斑魚種序列條數(shù)占全部魚類序列條數(shù)的百分比，計(jì)算公式如下：?????=(????????????????)×100%·····························································(A.2)式中：Rs——特定石斑魚物種相對豐度，單位為%；Sn——特定石斑魚物種的序列條數(shù)，單位為條；Tn——全部魚類序列條數(shù)，單位為條。5