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1、重組醬油曲霉堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白制備抗氧化肽的研究朱永麗亶松鎣殷爽劉_^何璐娜韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院利用重組醬油曲霉堿性蛋Q酶（rAp）對(duì)大豆分離蛋Q進(jìn)行水解，制備Y抗氧化肽;進(jìn)一步對(duì)抗氧化肽的抗氧化能力和苦味情況等方而進(jìn)行了研允.結(jié)果表明:重組堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白具有較強(qiáng)的水解效果，當(dāng)酶與底物比（E/S）為3OOOU/g時(shí)，大豆分離蛋白的水解度達(dá)到17.09%;當(dāng)E/S為5000U/g時(shí)，抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)83.38%,對(duì)亞汕酸也具奮較強(qiáng)的抗氧化性，并且該抗氧化肽的苦味不明顯.在同樣條件下，rAp對(duì)大豆分離蛋
2、白的水解效率、抗氧化肽的活性和低苦味均優(yōu)于商品化的堿性蛋G酶和木瓜蛋G酶.這些結(jié)果表明rAp具有較好的應(yīng)用潸力，并且其抗氧化肽在化妝品、飼料和食品等行業(yè)中也具有較好的應(yīng)用前景.關(guān)鍵詞：重組醬油曲霉蛋Q酶;大豆分離蛋Q;抗氧化肽;.則樣品的水解度為:DH(%)=100(1000X0.IX(V,-Vo)/5.OO/c-O.33)/7.8式中:c為樣品中原大豆分離蛋白的濃度，g/L；O.33為大豆分離蛋白中游離氨基酸的濃度，mmol/g;7.8為每克大豆分離蛋G的肽鍵當(dāng)量數(shù)，mmol/g.1.2.6抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定利用DPP
3、H無水乙醇在517nm有紫色團(tuán)的特征吸收峰，以分光光度計(jì)測(cè)定加入活性肽后，在517nm處吸收值的下降表示其對(duì)DPPH自由基的清除能力[8_9].在2mL離心管中加入1inL2XlOmol/L的DPPH無水乙醇溶液，再加入1inL抗氧化活性肽的無水乙醇，混勻，在室溫下30min后，517nm處測(cè)得吸光值A(chǔ),，同時(shí)測(cè)定1niL2X10mol/L的DPPH無水乙醇溶液與1mL無水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)。，以及1mL抗氧化活性肽與2mL無水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)』.DPPH自由基的清除率計(jì)算公式如下：1.2.7抗氧化肽的硫氰酸鐵測(cè)定法向試管中加入1mL
4、抗氧化劑活性肽的無水乙醇溶液，然后加入1mL2.5%亞油酸無水乙醇熔液、2mL0.05mol/Lp11為7.0的磷酸緩沖液、1mL蒸餾水，密封.空白對(duì)照以無水乙醇代替抗氧化活性肽，4°C保存.從0時(shí)刻開始計(jì)，每24h檢測(cè)一次.檢測(cè)時(shí)，取出0.1mL亞油酸乳化液于空試管中，加入9mL無水乙醇、0.1mL30%硫氰酸氨溶液、0.1mL0.02mol/L溶于3.5%鹽酸的氯化亞鐵溶液，迅速混勻，反應(yīng)3min后，于500nm處檢測(cè)其吸光值.1.2.8抗氧化肽的苦味評(píng)價(jià)稱取PTC配成的濃度1/750mol/L,編為1號(hào)液.并依次將1號(hào)溶液按倍比法稀釋
5、.并編號(hào)為PM號(hào)液，分別裝入消毒好的飲用杯中.將3種酶E/S為8000U/g制得的大豆多肽與不同濃度的PTC溶液進(jìn)行感官苦味評(píng)定，從而確定大豆多肽的苦味值.苦味評(píng)定小組由實(shí)驗(yàn)室9位冇相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的志愿者組成.進(jìn)行感官評(píng)定之前，要對(duì)評(píng)定小組成員進(jìn)行苦味評(píng)定培訓(xùn)，使其適應(yīng)苦味評(píng)定，品嘗結(jié)果的平均值為該樣品的最后苦味值.2結(jié)果與分析2.1重組醬油曲霉堿性蛋白酶的表達(dá)純化結(jié)果對(duì)工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白酶的純化結(jié)果如圖1所示.由圖1nJ?見，箭尖指向的蛋白條帶為重組堿性蛋白酶，這是由丁?該蛋白酶基因推測(cè)的蛋白理論大小約為35.0kDa,電泳所得的蛋白條
6、帶與理論推測(cè)一致.由圖1進(jìn)一步表明本試驗(yàn)獲得了電泳純的重組蛋白酶.閣1重組堿性蛋白酶的純化電泳閣下載原閣2.2重組堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解結(jié)果重組醬油曲霉堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解結(jié)果如圖2所示:在E/S為1000U/g、3000U/g、5000U/g、8000U/g的條件下，木瓜蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解度分別為1.64%、4.06%、6.21%、8.71%;重組醬油曲霉堿性蛋Q酶對(duì)大豆分離蛋Q的水解度分別為7.83%、17.09%、19.53%、19.43%;堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解度分別為11.
7、88%、12.23%、12.78%、14.78%.木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶隨著E/S的增加對(duì)大豆蛋白的水解度持續(xù)升高；而重組醬油曲霉堿性蛋白酶E/S達(dá)到5000U/g時(shí)對(duì)大豆分離蛋白的水解度趨于穩(wěn)定.總體而言，在E/S相同的情況下，重組醬油曲霉堿性蛋白酶的對(duì)豆分離蛋白的水解效率和水解程度均明顯高于商品化的木瓜蛋0酶和堿性蛋0酶.圖2重組醬油曲霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解效果2.3抗氧化肽的抗氧化性分析表3抗氧化肽對(duì)DPP11自由棊清除率結(jié)果2.3.1抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除率重組醬汕曲霉堿性蛋白酶與2種商品化蛋白酶
8、制備的抗氧化肽對(duì)DPPH自由的基清除率結(jié)果見表1.由表1可知，隨著E/S的比例增加，制備的抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除效果越強(qiáng)，當(dāng)E/S為5000U/g時(shí)，重組醬油曲霉堿性蛋白
