探究不同濃度南蛇藤素對(duì)人肺癌細(xì)胞的抑制作用

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1、探究不同濃度南蛇藤素對(duì)人肺癌細(xì)胞的抑制作用　　肺癌已成為危害生命健康的主要疾病之一，其發(fā)病率與死亡率逐年上升.2012年美國(guó)死于肺癌人數(shù)約16.0萬(wàn)，新增肺癌患者約22.6萬(wàn).在我國(guó)城市中，肺癌死亡人數(shù)由原來(lái)的第4位上升為第1位，農(nóng)村上升最快的死亡人數(shù)也是肺癌患者.調(diào)查顯示在過(guò)去30年間，肺癌死亡率在我國(guó)上升了46.5%，肺癌已成為我國(guó)惡性腫瘤死亡主要原因之一.肺癌發(fā)生于支氣管粘膜上皮，亦稱支氣管肺癌.肺癌一般指的是肺實(shí)質(zhì)部的癌癥，非小細(xì)胞肺癌則占肺癌總數(shù)的80%，其5年生存率僅為15%?！　　　〗陙?lái)，大量的研究表明:天然植物中存在具有治療價(jià)值的抗癌藥物，天然植物

2、藥物以其所特有的低毒、有效、無(wú)耐藥性及整體調(diào)節(jié)等方面的優(yōu)勢(shì)，在腫瘤治療中起著越來(lái)越重要的作用.雷公藤紅素(Celastrol)，又名南蛇藤素，是從傳統(tǒng)中藥衛(wèi)矛科植物雷公藤屬(TripterygiumHook)及南蛇藤屬(CelastrusL)，植物中分離出的活性較高的五環(huán)三萜類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性，是雷公藤片和雷公藤多甙片中的有效成分，廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腫瘤等有關(guān)疾病的治療.近來(lái)多項(xiàng)研究表明，雷公藤紅素可以抑制多種腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，同時(shí)，能夠通過(guò)ＲOS介導(dǎo)的上調(diào)CHOP通路，下調(diào)促生存蛋白和上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)增強(qiáng)TＲAIL

3、誘導(dǎo)的人類乳腺癌細(xì)胞凋亡.本研究通過(guò)不同濃度的雷公藤紅素處理人肺癌細(xì)胞，檢測(cè)藥物對(duì)這兩種細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用、細(xì)胞凋亡及其形態(tài)的影響，為肺癌的臨床預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)?！　　　?材料與方法　　　　1.1材料　　　　1.1.1細(xì)胞株:人肺癌細(xì)胞(H727細(xì)胞、H1299細(xì)胞)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。　　　　1.1.2試劑:ＲPMI－1640培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，磷酸緩沖生理鹽水PBS，胰蛋白酶(均購(gòu)于Gibco公司)，雷公藤紅素(購(gòu)于上海源葉生物有限公司，純度≧98%).DMSO(二甲基亞砜，購(gòu)于上海生工生物工程有限公司)，

4、DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，購(gòu)于美國(guó)Ｒoche公司)?！　　　?.2方法　　　　1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)　　　　H727、H1299細(xì)胞細(xì)胞株用含有10%的滅活胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)100μg/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、pH7.4的ＲPMI-1640完全培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)?！　　　?.2.2雷公藤紅素的配制雷公藤紅素用DMSO(二甲基亞砜)配成100mmol/L的母液，－80℃儲(chǔ)存.使用前，用含10%胎牛血清的ＲPMI-1640培養(yǎng)液配成不同濃度的工作液，DMSO的終濃度不超

5、過(guò)0.1%?！　　　?.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5104個(gè)/mL，按每孔100μL接種于96孔板，放置于37℃、5%的CO2孵箱中過(guò)夜培養(yǎng).待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入不同濃度(0，0.25，0.5，1，2μmol/L)的雷公藤紅素工作液.同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞，只有ＲPMI-1640培養(yǎng)液為對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)平行孔.培養(yǎng)24和48h后，每孔再加MTT(5mg/mL)10μL，放置于37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)4h，向每孔加150μL的DMSO，震蕩10min，用酶標(biāo)儀在492nm處測(cè)定OD值.按下式計(jì)

6、算不同濃度的藥品對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)活性的影響，細(xì)胞活性=(給藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)100%?！　　　?.2.4流式細(xì)胞儀測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5105個(gè)/mL，接種細(xì)胞到6孔板內(nèi)，放入37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，待其長(zhǎng)至80%無(wú)血清培養(yǎng)18h使細(xì)胞同步化.取出6孔板，放在超凈工作臺(tái)上，吸盡培養(yǎng)液，依次加入預(yù)先配制好的濃度分別為0、0.5、1μmol/L的雷公藤紅素溶液2mL于準(zhǔn)備處理的細(xì)胞中，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞及其上清液，用凋亡試劑盒進(jìn)行處理，并進(jìn)行流式檢測(cè)?！　　　?.2.5DAPI染色測(cè)腫瘤細(xì)胞形態(tài)

7、將對(duì)數(shù)期的H727和H1299細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，細(xì)胞數(shù)目為1106/孔，放入37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，待其長(zhǎng)至80%無(wú)血清培養(yǎng)18h使細(xì)胞同步化.取出6孔板，分別加入濃度為0μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L的雷公藤紅素，放入37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)處理24h.PBS清洗2遍，避光加入DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色液0.5ml，室溫避光孵育5－10min，PBS清洗4－5遍，用熒光顯微鏡觀察?！　　　?結(jié)果分析　　　　2.1不同濃度的雷公藤紅素對(duì)H727細(xì)胞、H1299細(xì)胞活性的影響