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《白藜蘆醇誘導大鼠原代脂肪細胞凋亡及機制》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、白藜蘆醇誘導大鼠原代脂肪細胞凋亡及機制：陳思凡，周妮曼，鄭琳，柯梁汝，單智銘，馮翔【摘要】【目的】探討白藜蘆醇(Res)對大鼠原代脂肪細胞凋亡的影響及其機制?！痉椒ā颗囵B(yǎng)大鼠原代脂肪細胞，添加不同劑量的Res干預，用Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài);用DNALadder實驗觀察DNA斷裂的條帶;檢測各組培養(yǎng)基和細胞內(nèi)的乳酸脫氫酶(LDH)含量，計算LDH漏出率;用流式細胞儀測定細胞凋亡率;ethods】Ratprimaryadipocytesorphologicaltransformat
2、ioninedicroscope.DNALadderassaycellapoptosis.TheLDHcontentinmediumandcellseasuredtocalculatetheLDHleakingratio.Thenumberofapoptoticcellsetry.Theexpressionofsilentinformationregulator1(Sirt1)，CytochromeC，CleavedCaspase9，CleavedCaspase3inedusingSO溶解，配置成80mmol/L
3、的儲備液，DMSO在培養(yǎng)基的終濃度低于0.1%)，DMSO，Ⅰ型膠原酶，Hoechst33258，購自美國Sigma公司;高糖DMEM培養(yǎng)基，新生牛血清，購自美國Gibco公司;DNAmarker，DNALadder檢測試劑盒，購自上海Beyotime公司;LDH檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;細胞凋亡測定試劑盒，購自美國BD公司;兔抗Sirt1單克隆抗體，購自英國abcam公司;兔抗CytochromeC、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3單克隆抗體，購自美國CST公司;兔抗
4、GAPDH單克隆抗體，購自武漢Boster公司;細胞漿蛋白抽提試劑盒，BCA試劑盒，HRP標記的抗兔二抗，購自上海Beyotime公司?！ ?.2方法 1.2.1大鼠原代脂肪細胞的培養(yǎng) 雄性SD大鼠10只，體質(zhì)量160～180g，購自廣東省實驗動物中心。原代脂肪細胞分離與培養(yǎng)實驗過程：取大鼠1只，麻醉處死后無菌分離附睪脂肪組織，以眼科剪剪200～300次，剪碎至1mm3以下，用1.5g/L的Ⅰ型膠原酶消化細胞，放入水浴搖床，100～120r/min，37℃水浴消化約40min，100目的網(wǎng)過濾，靜置于離心管約
5、5min，脂肪細胞自然上浮，將成熟的脂肪細胞用培養(yǎng)基重復洗2次，在培養(yǎng)管中加入無酚紅的DMEM培養(yǎng)基(100mL/L新生牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL鏈霉素)，觀察細胞狀況。取3只SD大鼠，按以上方法分離培養(yǎng)原代脂肪細胞，按照下面的實驗方法添加不同劑量的Res，在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2、95%濕度的細胞培養(yǎng)箱里進行細胞培養(yǎng)和干預試驗。各實驗重復3次?！ ?.2.2Hoechst33258染色 細胞用20、40、80μmol/L的Res作用12h，對照組添加相等量的DMSO作為參照，藥物
6、處理完畢后用PBS洗滌2次，用甲醇/冰醋酸(3：1)于4℃固定10min，洗滌后用Hoechst33258(濃度為5mg/L)避光染色15min。用PBS洗滌1次。進行細胞計數(shù)后，取約6000個細胞均勻涂在載玻片上，用甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照(激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長420nm)?！ ?.2.3DNALadder實驗 細胞經(jīng)過20、40、80μmol/L的Res干預6h或12h后，按照DNALadder試劑盒說明書，利用離心柱抽提法，抽提并純化各組細胞的DNA，取20?滋L的DNA樣品，加6×DN
7、A上樣緩沖液(體積分數(shù)30%甘油，0.25%溴酚藍)，在質(zhì)量分數(shù)1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.5?滋g/mL溴化乙錠)中進行電泳(40V，電泳約3h)，染料泳動至2/3處。在凝膠成像分析儀上對凝膠進行拍照，觀察DNALadder的形成?！ ?.2.4乳酸脫氫酶含量的檢測 收集各組的培養(yǎng)基和細胞，細胞在PBS中重懸，通過超聲裂解細胞，按照LDH檢測試劑盒說明書，檢測并計算各組培養(yǎng)基和細胞內(nèi)的乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase，LDH)含量。LDH漏出率(%)=c培養(yǎng)基(LDH)/(c培養(yǎng)基(LDH)
8、+c細胞內(nèi)(LDH))?！ ?.2.5流式細胞儀測定細胞凋亡率 細胞經(jīng)20、40、80μmol/L的Res干預12h后，收集各組細胞，按照細胞凋亡率測定試劑盒的方法，分別添加AnnexinV和7-AAD，處理后在流式細胞儀上測定細胞凋亡率?！ ?.2.6CytochromeC、CleavedCaspase9、CleavedCaspase3的蛋白表達 用NP40裂解細胞
