β分泌酶底物肽對阿爾茨海默病細(xì)胞模型的保護(hù)作用

《β分泌酶底物肽對阿爾茨海默病細(xì)胞模型的保護(hù)作用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、β分泌酶底物肽對阿爾茨海默病細(xì)胞模型的保護(hù)作用【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默病;β分泌酶底物肽;AD細(xì)胞模型　　ABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectofβscretasesubstratebasepeptide(BACEsp)oncellularmodelofAlzheimersdisease(AD).MethodsThecellularmodelofADestablishedacellSKNSHinducedbyamyloidprecursorprotein(APP)munoc

2、ytochemistryent.ResultsCellviabilityandAPPexpressioninthecellsthathadbeenfirstinfectedbyrebinantretroviruspLXSNBACEspodelofAD.　　KEY購自GIBCO公司;兔抗人APP抗體和SABC免疫組織化學(xué)試劑盒(即用型)購自武漢博士德生物公司;引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。LeicaDM16000B型圖象分析系統(tǒng)(德國);ELx800型酶標(biāo)儀(美國)。　　1.2細(xì)胞培養(yǎng)及G418篩選SK

3、NSH細(xì)胞用含100mL/LFBS的DMEM[H]培養(yǎng)液，37℃、50mL/LCO2常規(guī)條件下培養(yǎng)，常規(guī)胰酶消化傳代。以0～1100μg/mL共12個(gè)濃度梯度加入G418，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，定為SKNSH細(xì)胞的G418篩選濃度?！　?.3pBV感染的檢測本實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)中成功得到了攜帶BACEsp基因的重組病毒pBV，以pBV感染過的SKNSH細(xì)胞基因組DNA為模板，以BACEsp基因擴(kuò)增的上游引物(5′CGGAATTCGTTACCATGACAAATATCAAGACGGAGG　　AGAT

4、CTCTGAAGTG3′)為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。　　1.4AD細(xì)胞模型的建立SKNSH細(xì)胞培養(yǎng)于經(jīng)多聚賴氨酸處理的96孔板，37℃、50mL/LCO2常規(guī)條件下培養(yǎng)48h，待細(xì)胞密度約為90%時(shí)換液，加入經(jīng)Lipofectamine2000TM介導(dǎo)的APP轉(zhuǎn)染液100μL/孔，培養(yǎng)96h，建立AD細(xì)胞模型。　　1.5實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)共分5組：空白對照組、正常對

5、照組、AD細(xì)胞模型組、pBV后處理組、pBV預(yù)處理組。前3組均以含100mL/LFBS的DMEM[H]培養(yǎng)，不經(jīng)pBV作用，pBV后處理組以pBV感染AD模型細(xì)胞，pBV預(yù)處理組是用APP轉(zhuǎn)染預(yù)先經(jīng)pBV感染過的SKNSH細(xì)胞。　　1.6細(xì)胞活性檢測各組細(xì)胞以2×105/mL的密度種入經(jīng)多聚賴氨酸處理的96孔板，常規(guī)培養(yǎng)48h后更換培養(yǎng)液，經(jīng)相應(yīng)處理96h后，加入MTT20μL，37℃、50mL/LCO2條件下培養(yǎng)4h，棄上清;加入DMSO150μL/孔，充分震蕩10min，酶標(biāo)儀于490nm波長測定A值?！　?/p>

6、1.7免疫細(xì)胞化學(xué)檢測各組細(xì)胞以2×105/mL密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上，在相應(yīng)條件下培養(yǎng)48h，預(yù)冷PBS洗3次;40g/L多聚甲醛溶液固定，PBS洗3次;1mL/LTritonX10015min，PBS洗3次;3mL/LH2O230min，PBS洗3次;入一抗(APP濃度1∶300)，4℃過夜，PBS洗3次;入鼠抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS洗3次;SABC復(fù)合物，37℃30min，PBS洗3次;DAB顯色5min，至棕色，蒸餾水洗2次，終止DAB反應(yīng);甘油封片，鏡下觀察，LeicaDM1

7、6000B型圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。　　1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以數(shù)據(jù)和圖表的形式表示，測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組間比較采用Studentt檢驗(yàn)。P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！　?.3各組細(xì)胞活性的比較以正常對照組細(xì)胞的A值記為100%，AD模型組和pBV后處理組較正常對照組的細(xì)胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);pBV預(yù)處理組與正常對照組的細(xì)胞活性相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與A

8、D模型組相比細(xì)胞活性高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)?！　?.4APP蛋白的表達(dá)情況正常對照組中未見免疫反應(yīng)染色陽性的細(xì)胞，AD模型組、pBV后處理組及pBV預(yù)處理組均可見免疫反應(yīng)染色陽性細(xì)胞。與正常對照組相比，pBV預(yù)處理組APP染色最強(qiáng)。測定APP免疫反應(yīng)陽性的灰度值，灰度值與蛋白的表達(dá)量呈反比關(guān)系(表1、圖3)。表1不同因素處理后SK