蜂毒素體外抑制內(nèi)皮細胞血管生成及其作用機制

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1、蜂毒素體外抑制內(nèi)皮細胞血管生成及其作用機制【摘要】目的：探討蜂毒素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（ECV304）血管生成的抑制作用及其機制.方法：體外培養(yǎng)ECV304細胞，分別測定蜂毒素對其增殖、遷移及形成管狀結(jié)構(gòu)的影響.采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的含量.應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測ECV304細胞VEGFmRNA和bFGFmRNA的表達.結(jié)果：經(jīng)蜂毒素作用后，ECV304細胞的增殖明顯受到抑制，24,48,72h的IC50分別為5.11,4.68,4.40mg/L.蜂毒素低、中、高濃度組和沙利度胺(

2、TLD)組ECV304細胞遷移數(shù)目(19.44±6.54),(11.17±2.85),(4.22±1.83)和(18.28±5.29)個，明顯低于空白對照組(42.33±9.63)個(P<0.01).蜂毒素低、中、高濃度組及TLD組形成管狀結(jié)構(gòu)的面積分別為(5947.22±973.72)，(1558.33±281.06)，(705.85±318.01)和(2928.92±735.67)μm2/視野，均低于空白對照組(7828.94±1202.54)μm2/視野(P<0.01).經(jīng)蜂毒素處理后，ECV304細胞分泌VEGF及bFGF的功能明顯下

3、降.熒光定量PCR證實，蜂毒素可降低ECV304細胞VEGFmRNA和bFGFmRN的表達.結(jié)論：體外實驗結(jié)果表明，蜂毒素具有抑制ECV304細胞血管生成的作用，這種效應(yīng)與血管內(nèi)皮細胞VEGF和bFGF的活性降低及其合成受到抑制有關(guān).【關(guān)鍵詞】蜂毒素內(nèi)皮血管新生血管生成抑制劑0引言血管新生在人體正常發(fā)育以及許多疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用，尤其與腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［1］.新生血管保證了腫瘤持續(xù)生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的有效供給.抑制腫瘤的血管新生，切斷腫瘤生長和轉(zhuǎn)移所依賴的"命脈"已經(jīng)成為當前治療腫瘤的重要策略之一［2］.蜂毒素是從蜂毒中提取的一種小分子

4、肽類物質(zhì)，既往的研究表明，它對多種腫瘤細胞的增殖具有較強的抑制作用［3-4］，是一個十分具有應(yīng)用前景的抗腫瘤天然藥物，但其作用機制尚不明確.本研究通過體外模擬血管生成，觀察蜂毒素對血管內(nèi)皮細胞的抑制作用，并探討其作用機制.1材料和方法1.1材料蜂毒素(批號：104K4016)和MTT(美國Sigma公司)；沙利度胺(thalidomide,TLD)(批號：0601181，常州制藥廠有限公司)；Transp;Dsystems公司)；經(jīng)典總RNA提取試劑盒，βactin，VEGF和bFGF引物(上海Sangon生物工程公司)；RealtimePCR反應(yīng)試

5、劑盒(德國Roche公司)；RNasin(美國Promega公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；XDS1B型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；Modle500型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioRad公司)；RotorGeneRG3000型熒光定量PCR儀(澳大利亞CorbetResearch公司)；人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304(中國科學院上海細胞研究所).1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)用含有100mL/L熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃，體積分數(shù)為50mL/LCO2，飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，2～3d傳代1次，實驗用對數(shù)生長期細胞

6、.1.2.2細胞增殖實驗取對數(shù)生長期ECV304細胞制成單細胞懸液，以每孔1×104/100μL接種于96孔板.在含10mL/L熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h(50mL/LCO2，37℃).加入含不同濃度蜂毒素的完全培養(yǎng)基100μL，對照組加等量PBS液.每組設(shè)6個復孔，常規(guī)條件下培養(yǎng).分別在24，48和72h進行MTT實驗：每孔加入質(zhì)量濃度為5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h后終止培養(yǎng).棄去上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，振蕩10min，酶標儀測定A492nm值，參比波長630nm.按下列公式計算蜂毒素對ECV304

7、細胞的增殖抑制率(Inhibitionrate，IR)：IR(%)=［1-(實驗組A值/對照組A值)］×100%，同時計算半數(shù)抑制濃度(IC50).1.2.3內(nèi)皮細胞遷移實驗在微孔膜小室裝置的聚碳酸脂濾膜上、下表面分別涂以5μg基質(zhì)膠和5μg纖維粘連蛋白，以含1g/L牛血清白蛋白的DMEM培養(yǎng)基為遷移介質(zhì).每個小室接種1×105/100μL細胞.實驗分組：蜂毒素2，4，8mg/L濃度組，TLD50mg/L濃度組及空白對照組.常規(guī)培養(yǎng)24h后，揭下濾膜，用棉簽拭去膜內(nèi)表面細胞，甲醇固定，HE染色.200倍光鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)每個視野的細胞數(shù)目，取平

8、均值.以遷移細胞數(shù)目變化表示蜂毒素對ECV304細胞遷移的影響，并按下列公式計算