青蒿琥酯誘導(dǎo)hl60細(xì)胞凋亡的研究

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1、青蒿琥酯誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡的研究作者：劉俊玲，虞榮喜，陳均法【摘要】　　本研究旨在研究青蒿琥酯體外誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡及其過程中Bcl2與ICAD蛋白表達(dá)的變化。采用MTT法測定青蒿琥酯對HL60細(xì)胞的生長抑制作用；用光學(xué)顯微鏡檢、瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)觀察和檢測青蒿琥酯誘導(dǎo)HL60細(xì)胞的凋亡；應(yīng)用蛋白印跡法檢測青蒿琥酯誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡過程中Bcl2與ICAD的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明：青蒿琥酯對HL60細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，并呈時間、劑量依賴性。48小時IC50值為18.33μg/ml，其增殖抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2、有關(guān)；Bcl2和ICAD在HL60細(xì)胞中均有表達(dá)，且隨藥物濃度的增高表達(dá)量逐漸降低。結(jié)論：青蒿琥酯可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡，Bcl2和ICAD在青蒿琥酯誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)途徑中可能是重要的調(diào)控因子?！娟P(guān)鍵詞】青蒿琥酯　HL60細(xì)胞系　細(xì)胞凋亡　　ApoptosisofHL60CellsInducedbyArtesunateInVitroAbstractThestudyedtoinvestigatetheeffectofartesunate(ART)ontheapoptosisofHL60cellsinvitroandt

3、heexpressionofBcl2andICADintheprocessofapoptosisinducedbyART.TheinhibitionofARTonHL60cellseansofMTTassay;cellapoptosisicroscopy,agarosegelelectrophoresis,floetry;I1640配制所需濃度；碘化丙啶（PI）、噻唑藍(lán)（MTT）為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞凋亡DNALadder提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；bcl2和ICAD單克隆抗體均為美國SantaCruz公司產(chǎn)品。

4、細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL60由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所提供。細(xì)胞按常規(guī)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)于含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT測定取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml，接種于96孔板，每孔100μl，青蒿琥酯終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64及128μg/ml，每孔100μl，設(shè)空白對照組。藥物分別作用24、48、72小時后，每孔加MTT20μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，離

5、心棄去上清液，每孔加入DMSO150μl，振蕩搖勻，在570nm酶標(biāo)儀上測吸光度值（A570），計算抑制率，求半數(shù)抑制濃度IC50。細(xì)胞抑制率（%）=（A對照－A實(shí)驗(yàn)/A對照）×100%細(xì)胞經(jīng)對照組、給藥組作用48小時后，收集細(xì)胞，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）洗2遍后，細(xì)胞制片機(jī)離心、制片，ulticycle2.50DNA分析軟件處理。Bcl2和ICAD表達(dá)的mol/LHEPES，pH7.0,250mmol/LNacl,0.1%NP40,5mmol/LEDTA）,蛋白酶抑制劑與細(xì)胞裂解液之比為1∶9，置于冰上裂解20分鐘，稍振蕩，4

6、℃10000rpm離心15分鐘，收集上清。用5×SDS上樣緩沖液變性蛋白，煮沸后以10μg蛋白／泳道等量上樣，12%SDSPAGE經(jīng)80V電泳分離至分離膠后，120V電泳分離不同分子量蛋白，以濕式轉(zhuǎn)膜法在4℃，250mA，2小時將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。取出膜并將與膠接觸面朝上置于5%的脫脂奶粉（pH7.4的TBST配制）室溫下輕輕搖動封閉2小時。分別加入一抗，分別是鼠抗人Bcl2濃度為1∶200，鼠抗人ICAD濃度為1∶100，兔多抗Betaactin濃度1∶1000為一抗（5%的脫脂奶粉，pH7.4的TBST配制）及1∶5000稀釋的辣根

7、過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗、羊抗兔Betaactin二抗（5%的脫脂奶粉，pH7.4的TBST配制），顯色，在暗室內(nèi)曝光攝片。以βactin作為內(nèi)參照。統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，三組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)以P<0.05或P<0.01為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。結(jié)果青蒿琥酯對于HL60細(xì)胞的增殖抑制作用不同濃度青蒿琥酯作用于HL60細(xì)胞24、48、72小時后的抑制率與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1），青蒿

8、琥酯對HL60細(xì)胞的增殖抑制作用呈明顯的時間劑量依賴性，24、48、72小時的IC50分別為52.61、18.33、0.81μg/ml。HL60細(xì)