甲基強(qiáng)的松龍對(duì)深低溫停循環(huán)大鼠腦保護(hù)作用的研究

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1、甲基強(qiáng)的松龍對(duì)深低溫停循環(huán)大鼠腦保護(hù)作用的研究作者：顧群，莫緒明，陳鳳，彭衛(wèi)，何曉敏，戚繼榮，顧海濤【摘要】目的觀察甲基強(qiáng)的松龍（MP）對(duì)深低溫停循環(huán)（DHCA）大鼠腦N甲基D天門冬氨酸受體R1（NMDAR1）表達(dá)的影響，探討MP對(duì)DHCA大鼠腦保護(hù)作用的機(jī)制。方法制作大鼠DHCA模型。雄性SD大鼠175只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、DHCA模型組和MP處理組。觀察DHCA60min，再灌注2、6、12h及1、2、3、7d時(shí)NMDAR1蛋白表達(dá)的變化以及腦組織超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，DHCA模型組和MP處理組大鼠NMDAR1蛋白表達(dá)均升高，于1d到達(dá)高峰，

2、后逐漸降低，于再灌注7d恢復(fù)至正常水平。MP處理組大鼠再灌注后2、6、12h，1、2d5個(gè)時(shí)間點(diǎn)NMDAR1表達(dá)明顯低于模型組（P<0.01）。腦組織超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)MP能抑制DHCA腦細(xì)胞凋亡。結(jié)論MP對(duì)DHCA大鼠腦組織具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制之一可能是與抑制NMDAR1蛋白表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】深低溫停循環(huán);甲基強(qiáng)的松龍;N-甲基-D-天門冬氨酸受體R1;腦保護(hù);蛋白表達(dá)　　深低溫停循環(huán)（deephypothermiccirculatoryar-rest，DHCA）技術(shù)自上世紀(jì)50年代誕生以來，已廣泛應(yīng)用于復(fù)雜和嚴(yán)重的先天性心臟病及大血管手術(shù)中，但其

3、可能并發(fā)腦損傷的問題尚未得到較好解決，DH-CA術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病率高達(dá)4%～25%。DHCA手術(shù)后患者近期不同程度出現(xiàn)手足舞蹈癥、抽搐，遠(yuǎn)期出現(xiàn)認(rèn)知障礙，兒童出現(xiàn)智力發(fā)育障礙等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥［1］。DHCA后腦組織缺血缺氧導(dǎo)致突觸前興奮性氨基酸（EAA）大量釋放和再攝取減少，從而激活突觸后N甲基D天門冬氨酸（NMDA）和α氨基3羥基5甲基4異戊丙酸（AMPA）受體，引起大量K+外流和Na+、Ca2+內(nèi)流，造成滲透分解和Ca2+相關(guān)性損害。本實(shí)驗(yàn)通過觀察甲基強(qiáng)的松龍（MP）對(duì)DHCA大鼠腦NMDA受體1（NMDAR1）蛋白表達(dá)的影響，以探討其腦保護(hù)機(jī)制?！?/p>

4、　1材料與方法　　1.1儀器與試劑　　早產(chǎn)兒培育箱、自制大鼠冰窩、水合氯醛（南京市兒童醫(yī)院提供）、MP（美國輝瑞制藥公司）、NMDA受體R1（SantaCruz公司），羊抗兔即用型SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒SA1022（武漢博士德公司）、DAB顯色劑（武漢博士德公司）、多聚賴氨酸（美國Sigma公司）、熒光倒置顯微鏡（德國蔡司）、801圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)）?！　?.2動(dòng)物　　成年健康雄性普通級(jí)SD大鼠（南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）175只，體重250～300g，隨機(jī)分為3組，A組（假手術(shù)組）15只;B組（DHCA模型組）和C組（MP處理組）各80只，每組再分

5、為DHCA后2、6、12h，1、2、3、7d共7個(gè)小組，每小組10只，其中DHCA后6h、1d兩個(gè)組為15只。術(shù)前6h禁食禁水。A組僅暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不降溫不阻斷;B組深低溫停循環(huán)60min;C組于深低溫停循環(huán)前30min腹腔注射MP，劑量為30mg·kg-1?！　?.3大鼠DHCA模型建立　　術(shù)前30min肌肉注射阿托品0.02mg·kg-1，5%水合氯醛6ml·kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。溫度計(jì)插入肛門3cm，用膠帶將其與鼠尾相固定，監(jiān)測(cè)肛溫。頸部正中切口，分別游離兩側(cè)頸總動(dòng)脈及左、右頸外動(dòng)脈，并雙重過線。游離一側(cè)股動(dòng)脈，動(dòng)脈置管，取動(dòng)

6、脈血作血?dú)夥治龊?，用肝素充滿連接管后接壓力換能器，多功能監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)血壓、心電變化及外周血氧飽和度。最后將大鼠放入特制的冰窩，物理降溫，每隔5min記錄體溫、心率、血壓以及血氧飽和度，調(diào)整降溫速度。當(dāng)肛溫降至21℃時(shí)，將大鼠取出，取動(dòng)脈血做血?dú)夥治龊螅?jīng)左股動(dòng)脈進(jìn)行肝素化（肝素鈉300IU·kg-1）。隨后用24G靜脈留置針順行穿刺左頸外靜脈，扎線固定后與三通相連。接著阻斷兩側(cè)頸總動(dòng)脈，最后用24G靜脈留置針逆行穿刺頸外動(dòng)脈，扎線固定留置針，與左側(cè)頸外靜脈的靜脈留置針相連，開始轉(zhuǎn)流。轉(zhuǎn)流后，將體溫維持在（21±1）℃之間，并記錄體溫、心率、血壓以及血氧飽和度。停

7、循環(huán)60min后，拔出頸外動(dòng)脈處留置針并結(jié)扎，回收其管道內(nèi)血液，經(jīng)左側(cè)頸外靜脈輸入，再退出其管內(nèi)留置針并結(jié)扎。最后松開兩側(cè)頸總動(dòng)脈處動(dòng)脈夾，恢復(fù)頸總動(dòng)脈血流，檢查穿刺處無出血后，逐層縫閉切口。然后將大鼠放入35℃早產(chǎn)兒培育箱復(fù)溫，恢復(fù)正常體溫4h后放置室溫下正常飼養(yǎng)?！　?.4免疫組化方法　　檢測(cè)NMDAR1蛋白表達(dá)各組取10只大鼠于DHCA后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用含4%多聚甲醛的0.1mol·L-1磷酸緩沖液經(jīng)心臟升主動(dòng)脈灌流固定，斷頭置于冰盒玻璃板上取出全腦，放入同樣固定液中再固定約24h，常規(guī)脫水石蠟包埋切片，厚度4μm，取4張連續(xù)切片，操作步驟按SABC試劑盒

8、操作說明進(jìn)行，陰性對(duì)照以PBS代替一抗