深低溫停循環(huán)下神經(jīng)生長因子的腦保護(hù)作用研究

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1、深低溫停循環(huán)下神經(jīng)生長因子的腦保護(hù)作用研究作者：祁泉,嚴(yán)勤,朱德明,蔣祖明,俞曉青,鄒文艷【摘要】目的建立一種新的深低溫停循環(huán)模型，研究深低溫停循環(huán)(DHCA)對(duì)兔大腦皮層、海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，探討DHCA下神經(jīng)生長因子的腦保護(hù)作用。方法健康新西蘭大白兔幼兔(0.5kg)20只，隨機(jī)均分為2組：實(shí)驗(yàn)組（給予生長因子）和對(duì)照組（不給予生長因子）。在DHCA前、后不同時(shí)間窗監(jiān)測血清S100β含量，并采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL染色法)觀察和測定腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。對(duì)照分析兩組不同時(shí)間窗S100β的變化以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組幼兔在DHCA后神經(jīng)細(xì)

2、胞凋亡數(shù)目顯著減少(P<0.05)，在DHCA后30min(T2)、1h(T3)、3h(T4)、5h(T5)、12h(T6)5個(gè)時(shí)間窗血清S100β蛋白含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論給予外源性神經(jīng)生長因子能明顯抑制海馬以及皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對(duì)深低溫停循環(huán)后的神經(jīng)細(xì)胞有良好的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】深低溫停循環(huán)；神經(jīng)生長因子Abstract:OBJECTIVEToestablishamodelofdeephypothermiecirculatoryarrest(DHCA)andstudytheneuralapoptosisinthehippocamp

3、usandcerebralcortex,investigatetheprotectiveeffectsofnervegrolydividedintoteasured．NeuralapoptosispusCA1regionandcerebralcortexofbrain．parelyanalysisthechangeofS100βandtheexpressionofneuralapoptosisinthehippocampusandcerebralcortexbetberofneuralapoptoticcellsinstudygroupS100βlevelsin(T2

4、),1h(T3),3h(T4),5h(T5),12h(T6)betpusandcerebralcortexandhasaprotectiveeffectonneuronalinjuryinducedbyDHCA.Keyiecirculatoryarrest;Nervegroiccirculatoryarrest，DHCA)能為心臟及大動(dòng)脈手術(shù)提供一個(gè)無血最佳手術(shù)視野，但停循環(huán)可使全身重要器官尤其是大腦處于缺血、缺氧狀態(tài)，造成一定程度上的腦組織損傷,如何預(yù)防這種損傷是近年來的研究熱點(diǎn)。近期許多研究證明神經(jīng)生長因子(nervegrol/kg)誘導(dǎo)后氣管插管，呼吸機(jī)(Neg

5、/kg，靜脈注射)及硫酸阿托品(0.02mg/kg，肌肉注射)。耳中動(dòng)脈內(nèi)置管，標(biāo)準(zhǔn)第二導(dǎo)聯(lián)持續(xù)心電監(jiān)測，持續(xù)監(jiān)測直腸溫度。1.3建立DHCA模型冰塊袋包埋幼兔，物理降溫，肛溫降至18℃時(shí)停止降溫，取動(dòng)脈血做血?dú)夥治龊?，使體溫維持在18℃左右。頸部正中切開皮膚，分離暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈以及鎖骨下動(dòng)脈，用無損傷動(dòng)脈夾夾閉，造成全腦缺血30min后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血流灌注。用電熱吹風(fēng)機(jī)給幼兔復(fù)溫，將體溫恢復(fù)到37℃左右，維持正常體溫4h后放置室溫下正常飼養(yǎng)。1.4NGF(美國RD公司提供)處理方法實(shí)驗(yàn)組兔在行DHCA前48h、24h、12h、后12h分別予NGF0.5μg/k

6、g耳緣靜脈注射，對(duì)照組則注射等量生理鹽水。1.5標(biāo)本采集與檢測1.5.1血清S100β蛋白檢測兩組均于麻醉誘導(dǎo)前(T1)、DHCA后30min(T2)、1h(T3)、3h(T4)、5h(T5)、12h(T6)、24h(T7)、48h(T8)和72h(T9)取耳中動(dòng)脈血，離心分離血漿于-80℃冰箱保存。采用ElISA法測定血清中S100β蛋白含量(S100β檢測試劑盒由美國ADL公司提供)。1.5.2海馬以及皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡檢測兩組動(dòng)物術(shù)后3天，在麻醉狀態(tài)下，經(jīng)一側(cè)頸總動(dòng)脈插管灌注37℃生理鹽水，沖洗出血管內(nèi)血液，直到靜脈引流出的液體變清。4℃4％多聚甲醛(150m1

7、)行頸總動(dòng)脈灌注，迅速開顱取腦，取中間塊放人相同固定液中繼續(xù)固定24h。冠狀切面切開兔腦，取出組織塊行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋并切片，片厚4μm，將石蠟切片常規(guī)脫水，用H-E常規(guī)染色以及用原位末端標(biāo)記法(TUNEL法,TUNEL試劑盒由美國CHEMICON公司生物公司提供)檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞。檢測程序按試劑盒操作說明進(jìn)行。TUNEL圖片結(jié)果采用Axioplan2imaging顯微圖象分析系統(tǒng)醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。切片在光學(xué)顯微鏡高倍放大視野下隨機(jī)選取腦皮層及海馬各10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞指數(shù)(凋亡細(xì)胞指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)