蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)研究

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1、蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)研究作者：黃忠林，宋九華，王應(yīng)紅【摘要】　　目的認(rèn)識蘇木素對胰蛋白酶作用活性的影響及蘇木素對胰蛋白酶作用的熒光性質(zhì)。方法用酶活性法觀察蘇木素對胰蛋白酶活性的影響；用紫外光譜和熒光光譜研究蘇木素對胰蛋白酶作用的光譜性質(zhì)。結(jié)果蘇木素對胰蛋白酶活性可產(chǎn)生競爭性抑制，抑制劑常數(shù)K1=6.13×10-5mol/L；蘇木素對胰蛋白酶的熒光猝滅效應(yīng)為靜態(tài)猝滅；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力。結(jié)論蘇木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，使胰蛋白酶分子構(gòu)象發(fā)生變化?！娟P(guān)鍵詞】蘇木素胰

2、蛋白酶熒光光譜紫外光譜酶活性中藥蘇木的主要成分蘇木素(Haematorylin)是組織、病理實(shí)驗(yàn)室中最常用的染色劑，可用于細(xì)胞核染色［1］。蘇木素具有收縮血管、中樞抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消腫、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和動物腸道中一種重要的蛋白水解酶，從該酶被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其進(jìn)行了一定的研究，如用胰蛋白酶為催化劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行降解的研究［3～5］。藥物對胰蛋白酶作用的性質(zhì)［6］及蘇木素與DNA作用的性質(zhì)的研究已引起重視［7］。本文主要通過紫外和熒光光譜法研究蘇木素與胰蛋白酶作用的性質(zhì)，從而獲得

3、蘇木素與胰蛋白酶作用時(shí)結(jié)構(gòu)變化、所處微環(huán)境等信息，探討蘇木素與胰蛋白酶相互作用的機(jī)制，并對蘇木素與胰蛋白酶作用活性的影響也進(jìn)行了研究?！　?器材　　1.1儀器熒光分光光度計(jì)，美國CaryEclipse（瓦里安）產(chǎn)品；雙光束紫外可見分光光度計(jì)TU－1901，北京普析產(chǎn)品；pH－3C型酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品?！　?.2藥品牛胰蛋白酶（生化試劑），上海海洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蘇木素（生物染色劑BS），成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品；硼酸（分析純），成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品?！　?方法　　2.1蘇木素對胰蛋白酶活性影響在恒溫水浴

4、箱中將酪蛋白、胰蛋白酶和蘇木素預(yù)熱，按酶活性的測定方法，在胰蛋白酶與酪蛋白的酶解反應(yīng)體系中加入不同體積的蘇木素溶液，測定蘇木素對酶活性的影響。胰蛋白酶活性及抑制常數(shù)測定參照　　3.4熒光猝滅常數(shù)及猝滅機(jī)理　　3.4.1蘇木素對胰蛋白酶的猝滅效應(yīng)一般情況下，可依據(jù)不同溫度下的結(jié)果區(qū)別是動態(tài)猝滅，還是靜態(tài)猝滅。對于動態(tài)猝滅，隨著溫度升高，將增加離子有效碰撞的數(shù)目，加劇電子的轉(zhuǎn)移，使熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增大。而對于靜態(tài)猝滅則溫度升高將降低復(fù)合物的穩(wěn)定性，使猝滅常數(shù)減小。本文以相同的實(shí)驗(yàn)條件，分別測定了在20，25℃下胰蛋

5、白酶的熒光猝滅光譜，以［F0/F－1］對［C］作Stern－Volmer圖見圖3。從圖3可以看出蘇木素在溫度低于25℃時(shí)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而降低，即符合靜態(tài)猝滅機(jī)理。當(dāng)猝滅體分子和熒光物質(zhì)分子之間形成新的復(fù)合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí)，服從Line所得到的同步熒光光譜圖僅顯示的是酪氨酸殘基的熒光，(b)△λ＝60nm時(shí)僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光，由圖5可以看出在此實(shí)驗(yàn)條件下，酪氨酸和色氨酸殘基熒光同時(shí)被猝滅，使其熒光強(qiáng)度下降，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生改變，但色氨酸殘基的最大發(fā)射波長發(fā)生了藍(lán)移，表明色氨酸基所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)，

6、引起了胰蛋白酶的構(gòu)象變化?！　　?結(jié)論蘇木素對胰蛋白酶活性可產(chǎn)生非競爭性抑制，抑制劑常數(shù)Ki=6.13×10-5mol/L；蘇木素對胰蛋白酶的熒光猝滅效應(yīng)為靜態(tài)猝滅，說明蘇木素能與胰蛋白酶形成復(fù)合物；蘇木素與胰蛋白酶之間的作用力主要表現(xiàn)為氫鍵和范德華力；蘇木素與胰蛋白酶可發(fā)生作用，改變了胰蛋白酶的構(gòu)象，而色氨酸所處環(huán)境的疏水性增強(qiáng)顯著。【參考