溶血對(duì)乙型肝炎病毒dna定量檢測(cè)的影響

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1、溶血對(duì)乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)的影響：潘春燕，謝春英，王燮衡，王愛(ài)琴【摘要】目的了解用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒DNA拷貝數(shù)時(shí)，溶血對(duì)乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)的影響。方法采集30例乙型肝炎患者血液，分離血清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，并同時(shí)配制出含不同濃度Hb血清管。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)含不同Hb濃度及不含Hb血清的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)，用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果當(dāng)標(biāo)本中Hb濃度小于32g/L時(shí)，Hb對(duì)檢測(cè)血清乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。結(jié)論當(dāng)Hb濃度較低

2、時(shí)，Hb對(duì)血清乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)無(wú)顯著影響，因此較低濃度溶血標(biāo)本可以進(jìn)行乙型肝炎病毒DNA的定量檢測(cè)。【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；DNA定量；溶血；PCR　　血清中乙型肝炎病毒DNA水平是判斷乙型肝炎病毒在體內(nèi)是否復(fù)制，患者傳染性高低及選擇治療方案的重要指標(biāo)。目前臨床一般采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)融匯了PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增，探針技術(shù)的高特異性，光譜技術(shù)的高敏感性等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)直接檢測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量的結(jié)果。但此技術(shù)可能與標(biāo)本狀態(tài)

3、密切相關(guān)，如溶血、脂血等。有研究表明Hb及其代謝產(chǎn)物可能與Taq酶相互作用，進(jìn)而抑制Taq酶的活性，使PCR擴(kuò)增效率明顯降低，導(dǎo)致定量測(cè)定結(jié)果偏低［1］。在臨床檢驗(yàn)標(biāo)本中，溶血標(biāo)本較為常見(jiàn)，究竟溶血到何種程度會(huì)對(duì)乙型肝炎病毒DNA定量結(jié)果產(chǎn)生影響？本文將探討不同程度溶血對(duì)乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)的影響?！　?duì)象與方法　　1.對(duì)象我們收集了ALT＞40U/L、HBsAg陽(yáng)性、HBeAg陽(yáng)性、HBcAb陽(yáng)性的乙型肝炎患者30例,其中男性17例，女性13例，年齡在18～53歲之間?！　?.試劑深圳匹基公司提供的乙型

4、肝炎病毒DNA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20070501）、乙型肝炎病毒DNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品?！　?.儀器BECKMAN全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀（型號(hào)：CoulterAc.Tdiffe）、Lightcycle熒光PCR擴(kuò)增儀(羅氏公司)、高速低溫離心機(jī)（Sigma公司）、干式恒溫器（杭州藍(lán)焰科技有限公司）、低溫冰箱（SANYO公司）?！　?.方法　　（1）模擬溶血標(biāo)本的制備：抽取30例乙型肝炎患者血液后，2小時(shí)內(nèi)離心分離血清，這種不含Hb的血清作為無(wú)Hb對(duì)照組，然后取每位患者600μl血清及適量紅細(xì)胞混合，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?/p>

5、。次日將含紅細(xì)胞的血清管取出放于室溫解凍，完全解凍后再將該管置于-20℃冷凍，如此反復(fù)凍融兩次，使得RBC完全破裂，釋放出Hb。在Coulter全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定每管紅細(xì)胞裂解后的Hb濃度，再用每位患者的血清稀釋?zhuān)沟肏b終濃度為4g/L、8g/L、16g/L、32g/L，這些標(biāo)本即為模擬溶血標(biāo)本?！　。?）乙型肝炎病毒DNA模板制備：取待測(cè)樣本及陰、陽(yáng)性對(duì)照（試劑盒備有）各100μl,分別加入到0.5ml的離心管中，再分別加入100μlDNA提取液1，震蕩混勻，13000rpm離心10min；吸棄上清液，再

6、加入25μl提取液2，震蕩至沉淀完全散開(kāi)，100℃干浴10min；冷至室溫后,13000rpm離心10min,保留上清液備用?！　。?）PCR擴(kuò)增：從試劑盒中取出乙型肝炎病毒DNA擴(kuò)增反應(yīng)液、Taq酶及UNG，室溫融化后按規(guī)定比例混合均勻，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)液，分裝于Roche毛細(xì)擴(kuò)增管中，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)2管陰性對(duì)照，1管強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照，1管臨界陽(yáng)性對(duì)照，4管乙型肝炎病毒陽(yáng)性工作標(biāo)準(zhǔn)品，其拷貝數(shù)分別為〗5.0×104、5.0×105、5.0×106、5.0×107拷貝/ml，將上述對(duì)照及樣本各加2μl于加好反應(yīng)

7、液的Roche毛細(xì)管中，短暫離心后上機(jī)擴(kuò)增。對(duì)檢測(cè)結(jié)果高于5.0×107拷貝/ml的標(biāo)本進(jìn)行稀釋后再擴(kuò)增，使其結(jié)果落在試劑盒檢測(cè)線(xiàn)形范圍內(nèi)?！　。?）核酸擴(kuò)增與熒光數(shù)據(jù)采集：擴(kuò)增條件設(shè)置為37℃孵育3分鐘；94℃變性1分鐘；再進(jìn)入40個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括92℃變性5秒，60℃退火及延伸30秒,在60℃時(shí)單點(diǎn)收集熒光信號(hào)；儀器檢測(cè)通道選擇F1通道?！　。?）分析條件設(shè)定：選擇F1通道，點(diǎn)擊Quantification進(jìn)入定量分析窗口，設(shè)定Analysis方式為proportional,選定Noisebank項(xiàng)，

8、閾值選定為剛好超過(guò)陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)據(jù)為準(zhǔn)?！　。?）數(shù)據(jù)分析：四個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品Ct值均須小于38.0，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的擬合度須小于-0.980，陰陽(yáng)對(duì)照品擴(kuò)增須符合預(yù)期要求，得出的待測(cè)樣品的拷貝數(shù)才為可信結(jié)果。　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將測(cè)得的乙型肝炎病毒DNA拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換成常用對(duì)數(shù)，再利用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各含Hb的血清組與無(wú)Hb的血清組間差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行差