雙歧桿菌脂磷壁酸對(duì)2型糖尿病大鼠c反應(yīng)蛋白的影響

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1、雙歧桿菌脂磷壁酸對(duì)2型糖尿病大鼠C反應(yīng)蛋白的影響　　C反應(yīng)蛋白(Creactiveprotein，CRP)是肝細(xì)胞在IL６等細(xì)胞因子作用下合成的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥、損傷等應(yīng)激反應(yīng)時(shí)其血清水平急劇升高。研究證實(shí)CRP在２型糖尿病患者體內(nèi)含量較高，且與該病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［1］。雙歧桿菌脂磷壁酸（lipoteichoicacid，LAT）是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗感染、抗腫瘤、降血脂和延緩糖尿病發(fā)生等生物學(xué)作用［2］。本實(shí)驗(yàn)通過研究青春雙歧桿菌脂磷壁酸對(duì)２型糖尿病大鼠血清CRP含量和肝細(xì)胞CRPmRNA表達(dá)水平的影響，探討其應(yīng)用在糖尿病預(yù)防及

2、臨床治療中的可行性?！　?材料與方法　　1.1藥品試劑及動(dòng)物　　鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購于Sigma公司；雙歧桿菌脂磷壁酸：按樂軍等［3］方法從青春雙歧桿菌中分離純化；大鼠C反應(yīng)蛋白ELISA試劑盒購于上海卓康生物科技有限公司；Trizol,RTPCR試劑盒及DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物購于Promega公司。　　健康雄性SD大鼠30只，清潔級(jí)，體質(zhì)量110～150g，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供?！　?．2分組及實(shí)驗(yàn)　　SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（對(duì)照組），糖尿病組和不同劑量的LAT干預(yù)組，每組6只。按照穆松牛等［4］方法制備大鼠2型糖尿病模型：糖尿病組和LAT干預(yù)

3、組大鼠飼喂高糖高脂飼料３周后一次性腹腔注射STZ每公斤體質(zhì)量25mg(STZ溶于檸檬酸枸櫞酸鈉緩沖液，所配濃度為10mg/mL)，３天后以比色法測(cè)定空腹血糖值；空腹血糖值≥17.0mmol/L即為２型糖尿病穩(wěn)定模型。LAT干預(yù)組大鼠分別腹腔注射1.0，2.0，4.0μg的雙歧桿菌脂磷壁酸（LAT溶于5ml生理鹽水中），每天1次；糖尿病組和對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水，6周后開始實(shí)驗(yàn)。　　1.3ELISA法檢測(cè)血清CRP含量　　大鼠實(shí)驗(yàn)前12h禁食不禁水，處死后心臟取血并分離血清，按照試劑盒說明測(cè)定血清CRP含量?！　?.4RTPCR法檢測(cè)肝細(xì)胞CRP基因表達(dá)　　分離大鼠肝臟，T

4、rizol法提取肝細(xì)胞總RNA。CRP和內(nèi)參GAPDH引物合成：CRP（326bp）上游引物：5′TATTTTCTCGTATGCCACCA3′，下游引物：5′TTTCCAATGTCTCCCACCAG3′；GAPDH（541bp）上游引物：5′TTAGCACCCCTGGCCAAGG3′，下游引物：5′CTTACTCCTTGGAGGCCATG3′。RTPCR法檢測(cè)CRP基因表達(dá)：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。取5μlPCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖電泳并用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)?！　?.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　　樣本PCR產(chǎn)物電泳條帶灰度分析采用BandLeader3.0軟件，以CRP/GAPD

5、H灰度比值表示CRP表達(dá)水平；數(shù)值均以±s表示，采用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用方差分析。　　2結(jié)果　　2．1大鼠2型糖尿病模型　　糖尿病組和LAT干預(yù)組大鼠均出現(xiàn)明顯的多食、多飲、多尿、體質(zhì)量下降癥狀；比色法測(cè)定空腹血糖值均≥17.0mmol/L。　　2．2血清CRP含量　　糖尿病組和對(duì)照組大鼠血清CRP含量分別為(5.67±0.13)mg/L和(1.96±0.13)mg/L，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）；LAT干預(yù)組大鼠血清CRP含量比糖尿病組低，隨LAT濃度增加CRP含量降低，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05），結(jié)果見表

6、1?！　?.3肝細(xì)胞CRP基因表達(dá)　　糖尿病組大鼠肝細(xì)胞中CRP/GAPDH(灰度比)高于對(duì)照組，不同劑量的LAT干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞中CRP/GAPDH(灰度比)均比糖尿病組低，呈濃度依賴性，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；結(jié)果見表1，圖1，圖2。表1雙歧桿菌脂磷壁酸對(duì)2型糖尿病大鼠血清CRP及肝臟CRPmRNA表達(dá)的影響（略）。　　3討論　　糖尿病是由多種原因引起的以慢性血糖升高和（或）伴有多器官系統(tǒng)損害為主要特征的一種內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，其病因與發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來，炎癥學(xué)說在2型糖尿病發(fā)病進(jìn)程中的促進(jìn)作用備受國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注［5-6］?！　”緦?shí)驗(yàn)結(jié)果中糖尿

7、病組大鼠血清內(nèi)的CRP含量明顯高于正常對(duì)照組和雙歧桿菌脂磷壁酸干預(yù)組。CRP作為一種顯示系統(tǒng)炎癥進(jìn)展程度的非糖基化聚合蛋白，是炎癥急性時(shí)相蛋白中最敏感的指標(biāo)，在多種病理生理過程中起媒介作用［7］。2型糖尿病患者的血清中往往含有多種高水平的炎性細(xì)胞因子，它們都直接和（或）間接地促進(jìn)該病及其并發(fā)癥的發(fā)生，其中以CRP的作用尤為顯著［1］。Wang等［8］證實(shí)CRP可以通過NFκB途徑激活多種炎癥相關(guān)基因的表達(dá)和炎癥介質(zhì)的釋放，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮功能紊亂。CRP可以促進(jìn)脂類