雌二醇的免疫膠體金試紙法檢測的論文

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1、雌二醇的免疫膠體金試紙法檢測的論文關(guān)鍵詞:雌二醇雌激素【關(guān)鍵詞】雌二醇　　雌二醇(17β-estradiol)是天然雌激素的重要成分，為防止兒童性早熟等問題，食品中尤其是畜禽產(chǎn)品的雌二醇檢測不容忽視。膠體金免疫層析技術(shù)(gica)在檢測小分子有機物方面越來越受到重視。其基本原理是膠體金顆粒能夠穩(wěn)定吸附蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的生物活性無明顯變化，所以它可以取代酶標記抗體〔1，2〕。本實驗采用標記有雌二醇單克隆抗體的膠體金顆粒與相對應(yīng)的固定在硝酸纖維膜上的雌二醇結(jié)合物相結(jié)合，固定有雌二醇結(jié)合物的檢測線處就顯現(xiàn)明顯的顏色〔3，4〕。本法具有靈敏度高、特異性強、簡便快速、成本較低、結(jié)果容易

2、判讀等優(yōu)點，適用于樣品的初步篩選?！　?材料與方法　　11試劑與儀器氯金酸(上?；瘜W(xué)試劑廠)；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗(天津聯(lián)星生物公司)；雌二醇標準品、雌二醇單抗、17β-estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)美國sigma公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。硝酸纖維膜、玻璃纖維膜（美國millipore公司)；beckmandu530分光光度計(德國beckman公司)；低溫高速離心機(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；點膜機(美國bio-dot公司)。.　　12方法　　121膠體金的制備用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為01g／l。先進行沸

3、水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100ml加入1％檸檬酸三鈉25ml，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩(wěn)定，繼續(xù)沸水浴10min〔5〕，冷卻至室溫后，用透射電鏡鏡檢并用分光光度計檢測顆粒均勻度及粒度。最后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩！　?22最適標記蛋白量的確定用02mol／lk2co3將膠體金溶液調(diào)至ph為82，然后取試管9支，分別加入10ml膠體金溶液。將雌二醇抗體逐級稀釋后，各取等體積稀釋液順序加入上述試管中，混勻，另設(shè)一不加抗體的對照管。放置10min，在各管中加入01ml的10％nacl，混勻后靜置2h。觀察各管中膠體金溶液變化，未加蛋白及加入量不足的溶液顏色由紅變藍

4、，而加入蛋白量達到或超過時的溶液則保持不變。標記蛋白量即為最低穩(wěn)定膠體金溶液不變色的蛋白量基礎(chǔ)上再加20％。　　123膠體金探針的標記將抗體用0005molnacl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉淀，調(diào)至05mg／ml。取膠體金100ml，用0，2mol／lk2co3將膠體金溶液調(diào)至ph為90，磁力快速攪拌下緩慢加入24ml稀釋的雌二醇抗體，繼續(xù)攪拌10min，加入牛血清白蛋白(bsa)，使其最終濃度為1％，再攪拌10min。將初步制得的膠體金探針以4000r／mm離心20min；棄沉淀，上清以10000r／min離心60min；棄上清，沉淀用001mol／l的磷酸鹽緩沖液(pb

5、s)(含1％牛血清白蛋白)重新懸??；同前離心洗滌2次，將沉淀用001mol／l的pbs(ph82，含1％bsa，002％nan3)懸浮，4℃保存?zhèn)溆??！　?24抗原的合成小分子物質(zhì)難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質(zhì)才能較好地固定。本實驗采用混合酸酐法制備完全抗原。雌二醇-6-肟43mg,加入三正丁胺50μl,二氧六環(huán)4ml，冰浴冷卻到10℃以下，加入氯甲酸乙酯15μl〔6〕。4～10℃下反應(yīng)30min。配制卵清白蛋白(ova)溶液(ova10mg，3ml水，3ml二氧六環(huán)，1mol／l氫氧化鈉03ml)。將配制好的ova溶液加入反應(yīng)液，4℃冰浴攪拌6h，反應(yīng)過程中

6、，用氫氧化鈉維持ph值為8。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液加入透析袋，透析2d。將透析液調(diào)至ph45，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉淀出現(xiàn)。離心收集沉淀，冷凍干燥，4℃冰箱保存。將ova溶于透析液內(nèi)作為參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-ova進行定性檢驗。經(jīng)紫外測定證明蛋白質(zhì)已與雌二醇衍生物結(jié)合?！　?25膠體金免疫層析試紙條制備測試條由玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、加樣紙、吸水紙4部分組成。將玻璃纖維膜裁成6mm的細條，然后放入含1％bsa、1％tin，37℃烘干，最后將膠體金探針灌注已處理好的玻璃纖維膜上，真空干燥備用。在硝酸纖維膜上用點膜機將上述抗原和兔抗鼠igg噴成2條線，分別為檢測線

7、和對照線，經(jīng)真空干燥后，用1％bsa、001mol／lpbs（ph90)封閉2h，以001mol／lpbs洗滌，再真空干燥。將30mm吸水紙、25mm硝酸纖維膜、6mm玻璃纖維膜、15mm加樣紙，由頂部依次粘于pvc板上，裁成細條備用?！　?26檢測與判讀樣品：含已知濃度雌二醇樣品的乙醇溶液分為3組，第1組不加雌二醇，第2組為02μg／ml雌二醇，第3組為04μg／ml雌二醇。將加樣紙一端插入待測液，濕潤后取出，水平放置，約3～5min，觀察結(jié)果。如試紙條硝酸纖維膜上僅對照線呈一條紫紅色帶為陽性；如出現(xiàn)