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1、雌二醇的免疫膠體金試紙法檢測【關(guān)鍵詞】雌二醇 雌二醇(17β-Estradiol)是天然雌激素的重要成分，為防止兒童性早熟等問題，食品中尤其是畜禽產(chǎn)品的雌二醇檢測不容忽視。膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)在檢測小分子有機(jī)物方面越來越受到重視。其基本原理是膠體金顆粒能夠穩(wěn)定吸附蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的生物活性無明顯變化，所以它可以取代酶標(biāo)記抗體〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)記有雌二醇單克隆抗體的膠體金顆粒與相對應(yīng)的固定在硝酸纖維膜上的雌二醇結(jié)合物相結(jié)合，固定有雌二醇結(jié)合物的檢測線處就顯現(xiàn)明顯的顏色〔3，4〕。本法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡便
2、快速、成本較低、結(jié)果容易判讀等優(yōu)點(diǎn)，適用于樣品的初步篩選。 1材料與方法 11試劑與儀器氯金酸(上?；瘜W(xué)試劑廠)；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗(天津聯(lián)星生物公司)；雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品、雌二醇單抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)美國Sigma公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。硝酸纖維膜、玻璃纖維膜（美國Millipore公司)；BeckmanDu530分光光度計(jì)(德國Beckman公司)；低溫高速離心機(jī)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；點(diǎn)膜機(jī)(美國Bio-Dot公司)?！ ?2方法
3、 121膠體金的制備用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為01g／L。先進(jìn)行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100ml加入1％檸檬酸三鈉25ml，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩(wěn)定，繼續(xù)沸水浴10min〔5〕，冷卻至室溫后，用透射電鏡鏡檢并用分光光度計(jì)檢測顆粒均勻度及粒度。最后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆??！ ?22最適標(biāo)記蛋白量的確定用02mol／LK2CO3將膠體金溶液調(diào)至pH為82，然后取試管9支，分別加入10ml膠體金溶液。將雌二醇抗體逐級稀釋后，各取等體積稀釋液順序加入上述試管中，混勻，另設(shè)一不加抗體的對照管。放置10mi
4、n，在各管中加入01ml的10％NaCl，混勻后靜置2h。觀察各管中膠體金溶液變化，未加蛋白及加入量不足的溶液顏色由紅變藍(lán)，而加入蛋白量達(dá)到或超過時(shí)的溶液則保持不變。標(biāo)記蛋白量即為最低穩(wěn)定膠體金溶液不變色的蛋白量基礎(chǔ)上再加20％?！ ?23膠體金探針的標(biāo)記將抗體用0005molNaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉淀，調(diào)至05mg／ml。取膠體金100ml，用0，2mol／LK2CO3將膠體金溶液調(diào)至pH為90，磁力快速攪拌下緩慢加入24ml稀釋的雌二醇抗體，繼續(xù)攪拌10min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其最終濃度為1％，再
5、攪拌10min。將初步制得的膠體金探針以4000r／mm離心20min；棄沉淀，上清以10000r／min離心60min；棄上清，沉淀用001mol／L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(含1％牛血清白蛋白)重新懸??；同前離心洗滌2次，將沉淀用001mol／L的PBS(pH82，含1％BSA，002％NaN3)懸浮，4℃保存?zhèn)溆谩！ ?24抗原的合成小分子物質(zhì)難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質(zhì)才能較好地固定。本實(shí)驗(yàn)采用混合酸酐法制備完全抗原。雌二醇-6-肟43mg,加入三正丁胺50μl,二氧六環(huán)4ml，冰浴冷卻到10℃以下，
6、加入氯甲酸乙酯15μl〔6〕。4～10℃下反應(yīng)30min。配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA10mg，3ml水，3ml二氧六環(huán)，1mol／L氫氧化鈉03ml)。將配制好的OVA溶液加入反應(yīng)液，4℃冰浴攪拌6h，反應(yīng)過程中，用氫氧化鈉維持pH值為8。反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液加入透析袋，透析2d。將透析液調(diào)至pH45，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉淀出現(xiàn)。離心收集沉淀，冷凍干燥，4℃冰箱保存。將OVA溶于透析液內(nèi)作為參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-OVA進(jìn)行定性檢驗(yàn)。經(jīng)紫外測定證明蛋白質(zhì)已與雌二醇衍生物結(jié)合?！ ?25膠體金免疫層析
7、試紙條制備測試條由玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、加樣紙、吸水紙4部分組成。將玻璃纖維膜裁成6mm的細(xì)條，然后放入含1％BSA、1％Tin，37℃烘干，最后將膠體金探針灌注已處理好的玻璃纖維膜上，真空干燥備用。在硝酸纖維膜上用點(diǎn)膜機(jī)將上述抗原和兔抗鼠IgG噴成2條線，分別為檢測線和對照線，經(jīng)真空干燥后，用1％BSA、001mol／LPBS（pH90)封閉2h，以001mol／LPBS洗滌，再真空干燥。將30mm吸水紙、25mm硝酸纖維膜、6mm玻璃纖維膜、15mm加樣紙，由頂部依次粘于PVC板上，裁成細(xì)條備用。 126檢測與判讀樣品
8、：含已知濃度雌二醇樣品的乙醇溶液分為3組，第1組不加雌二醇，第2組為02μg／ml雌二醇，第3組為04μg／ml雌二醇。將加樣紙一端插入待測液，濕潤后取出，水平放置，約3～5min，觀察結(jié)果。如試紙條硝酸纖維膜上僅對照線呈一條紫紅色帶為陽性；如出現(xiàn)2條紫紅色帶為陰性；如質(zhì)控線
