急性肺損傷中性粒細(xì)胞膠原酶表達(dá)異常及甲基強(qiáng)的松龍調(diào)控的研究論文

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1、急性肺損傷中性粒細(xì)胞膠原酶表達(dá)異常及甲基強(qiáng)的松龍調(diào)控的研究論文陸衛(wèi)華曾尟枚許喜詠程青唐忠志【摘要】目的：探討急性肺損傷時(shí)肺組織中性粒細(xì)胞膠原酶的表達(dá)及甲基強(qiáng)的松龍調(diào)控關(guān)系。方法：SD大鼠45只，分為3組：1組生理鹽水正常對(duì)照組，2組內(nèi)毒素(LPS)致病組，3組內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組。組2、組3分別由尾靜脈注射內(nèi)毒素(5mg/kg)造成大鼠急性肺損傷模型，組1則注入生理鹽水。內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組在實(shí)驗(yàn)造模前2d由腹腔注射甲基強(qiáng)地松龍10mg/kg，1次/d，組1、組2、組3分別于注射后6h建模后各組均取左肺標(biāo)本，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肺組織中中性粒

2、細(xì)胞膠原酶的表達(dá).freelg/L苯巴比妥鈉(30mg·kg-1)麻醉,5min后經(jīng)尾靜脈注射(5mg·kg-1)LPS復(fù)制大鼠ALI模型。生理鹽水對(duì)照組注射同量生理鹽水。內(nèi)毒素(LPS)+甲基強(qiáng)的松龍組在實(shí)驗(yàn)造模前2d由腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍10mg/kg，1次/d。造模后6h分別經(jīng)靜脈注射過量的苯巴比妥鈉處死，取左下葉肺組織一塊，-70℃凍存待檢。對(duì)照組大鼠不注射LPS，處死后取左下葉肺組織。1.3測(cè)肺組織中性粒細(xì)胞膠原酶檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)SABC法，一抗是多克隆山羊抗大鼠中性粒細(xì)胞膠原酶抗體(中山生物公司)。肺組織石蠟包埋后切片，固定于多聚賴氨酸處理過的載玻片

3、上。經(jīng)梯度乙醇脫水、脫蠟后，又經(jīng)甲醇處理5min后，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。磷酸緩沖液(pH6．0)120℃加熱5min。滴加一抗孵育30min，然后滴加二抗，再孵育30min后，加入顯色劑DAB。細(xì)胞漿中顯棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，以半定量的方法判斷結(jié)果，陽性細(xì)胞定量參數(shù)用MPIAS-1000型光密度自動(dòng)分析儀(Nikon，Japan)進(jìn)行檢測(cè)。1.4肺組織病理損傷評(píng)分標(biāo)本經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察。根據(jù)Tomashefski等介紹的10個(gè)觀察指標(biāo)(肺泡上皮細(xì)胞破壞、毛細(xì)血管阻塞、肺間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)水腫、出血、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、多型核細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間質(zhì)水腫、透明膜形成、間質(zhì)膠

4、原降解)判斷肺損傷：分4個(gè)級(jí)別，0為未觀察到損傷、1為輕度、2為中度、3為重度。每張切片各觀察指標(biāo)病理評(píng)分的總和為該切片總評(píng)分，每組觀察5張切片，取均值。1.5肺組織干/濕質(zhì)量比取左下葉肺組織稱量，70℃烘烤24h后再稱量，計(jì)算肺干/濕質(zhì)量比。1.6肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)本經(jīng)HE染色后在400倍顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用均數(shù)方差分析，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行處理，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P0．05為差異有顯著性。2結(jié)果各組大鼠中性粒細(xì)胞膠原酶含量、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺干/濕質(zhì)量比、病理

5、評(píng)分結(jié)果見表1。HE染色結(jié)果顯示:C組中未見到肺組織炎癥反應(yīng)見（圖1）,L組可觀察到嚴(yán)重的肺炎癥反應(yīng)見（圖2）,即中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、透明膜形成、肺泡間組織腫脹突入肺泡腔中,M組肺炎癥較L組減輕見（圖3）。中性粒細(xì)胞膠原酶染色結(jié)果顯示:C組中幾乎未見中性粒細(xì)胞膠原酶染色陽性的中性粒細(xì)胞,L組可見強(qiáng)陽性染色中性粒細(xì)胞,并且主要定位于細(xì)胞漿中，M組中中性粒細(xì)胞膠原酶染色陽性的中性粒細(xì)胞較L組減少。表1各組大鼠中性粒細(xì)胞膠原酶相對(duì)含量、肺病理損傷評(píng)分、肺干／濕質(zhì)量比、肺內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)3討論急性肺損傷是急性創(chuàng)傷和感染常見病。在臨床ICU所有治療病例中，由細(xì)菌內(nèi)毒素所引發(fā)的AL

6、I和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)占有重要比例，其發(fā)病率和病死率均較高［2,3］。在對(duì)ALI的研究中，均可以觀察到有大量中性粒細(xì)胞在肺組織中聚集，而中性粒細(xì)胞可以釋放多種炎癥介質(zhì)導(dǎo)致ALl的發(fā)生［4,5］，因而目前對(duì)于這些炎癥介質(zhì)的研究是一個(gè)熱點(diǎn)。人體組織器官是由各種細(xì)胞成分及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)構(gòu)成，ECM是維系器官結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基礎(chǔ)．在器官構(gòu)成中起"框架"作用。中性粒細(xì)胞膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶中的一種，僅來源于成熟分化的中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞膠原酶能降解ECM中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原成分，而這3種膠原成分是ECM中的重要組成成分，對(duì)組織結(jié)構(gòu)起連接、支持、穩(wěn)定作用，所以，

7、在炎癥反應(yīng)性疾病中，中性粒細(xì)胞膠原酶分泌增多，必然大量分解ECM中的膠原成分，造成組織器官結(jié)構(gòu)與功能破壞，持續(xù)釋放大量的毒性內(nèi)容物加劇肺損傷的病理過程，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全符合此結(jié)論［6,7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示在急性肺損傷組中性粒細(xì)胞膠原酶含量顯著高于生理鹽水正常對(duì)照組和內(nèi)毒素(LPS)甲基強(qiáng)的松龍組。說明急性肺損傷組中性粒細(xì)胞膠原酶含量明顯異常。內(nèi)毒素(LPS)急性肺損傷組和內(nèi)毒素(LPS)甲基強(qiáng)的松龍組中性粒細(xì)胞膠原酶含量差異有顯著性。內(nèi)毒素(LPS)甲基強(qiáng)的松龍組中性粒細(xì)胞膠原酶含量較內(nèi)毒素急性肺損傷組比例顯著減少。說明甲基強(qiáng)地松龍能夠調(diào)控油酸內(nèi)毒素(LPS)造