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1、中性粒細(xì)胞在大鼠急性重癥胰腺炎肺損傷中的作用機(jī)制作者：徐軍，劉學(xué)民，馬清涌，潘承恩【關(guān)鍵詞】急性病ExperimentalstudyonPMNinacuteseverepancreatitisorphonuclearneutrophils(PMN)frombronchoalveolarlavagefluidinacuteseverepancreatitis(ASP)andtodiscusstherelatedmechanism.METHODS:FortyEightmaleSDratsodelepoint.Atscheduledtime,bronchoalveolarl
2、avagefluidethod.TheratioofapoptosisandnecrosisofPMNetryandLDHaseabilityeasured.RESULTS:InASPgroup,thesurvivalratioofPMNincreasedandapoptosisofPMNeabilityalsoincreased.CONCLUSION:ThedelayofPMNapoptosisleadstopersistentactivationandleakageoftoxiccontentsofPMN,acia公司產(chǎn)品，AnnexinvFITC凋亡檢測(cè)試劑盒(
3、AnnexinvFITCApoptosisDetectionKit)系Sigma公司產(chǎn)品.采用Hitachi7170全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀FACS.calibur，Hitachi600型透射電鏡. 1.2方法 將大鼠于實(shí)驗(yàn)前12h禁食，自由飲水，采用100g/L氯氨酮80mg/kgip麻醉，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組各24只.常規(guī)消毒，腹正中切口進(jìn)入腹腔.實(shí)驗(yàn)組分別于十二指腸及肝門端用小動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉阻斷胰膽管.近肝門端用4號(hào)頭皮針穿刺胰膽管，1min內(nèi)勻速注入35g/L?；悄懰徕c1mL/kg,壓迫注射點(diǎn)，5min后去除動(dòng)脈夾，逐層關(guān)閉腹腔，完
4、成ASP模型制作.對(duì)照組僅翻動(dòng)十二指腸.實(shí)驗(yàn)及對(duì)照組大鼠均每8只為一時(shí)間點(diǎn)，分別于術(shù)后3,6,12h剖殺.解剖分離肺，由主氣管插入塑料管，注入10mLPBS液，反復(fù)灌洗3次，回收液體，回收率約80％左右.灌洗液經(jīng)離心后，分別留取上清及細(xì)胞沉淀.將細(xì)胞沉淀用PBS液重新懸浮，用密度梯度離心Percoll液（密度分別為1.085和1.095）行密度梯度離心（700g4℃30min），吸取PMN富集層并進(jìn)一步洗脫純化，將所獲PMN稀釋至1mL備用.肺泡灌洗液及血液乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè).用光鏡及電鏡觀察肺組織的病理變化.取肺泡灌洗上清液，測(cè)定白蛋白
5、及總蛋白含量，計(jì)算白蛋白/總蛋白比值. 1.2.1PMN凋亡/壞死細(xì)胞定量取上述PMN懸浮液，加500μL細(xì)胞懸液于試管中,加入5μL用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的AnnexinV和10μL的碘化丙啶(PI)，室溫下避光放置10min，采用膜聯(lián)蛋白VFLUOS和碘化丙啶雙標(biāo)法，用流式細(xì)胞儀雙通道檢測(cè)5000個(gè)細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)515,610nm.膜聯(lián)蛋白Ｖ陽性為凋亡早期細(xì)胞，PI陽性為壞死細(xì)胞，膜聯(lián)蛋白V，PI雙陽性為凋亡晚期/壞死細(xì)胞. 1.2.2肺髓過氧化物酶活性測(cè)定取肺組織加鄰聯(lián)茴香胺制成肺組織勻漿.凍融并超聲粉碎，離心后取上清加反應(yīng)液，
6、在分光光度計(jì)460nm波長(zhǎng)下進(jìn)行2min掃描，記錄第30s和第90s的吸光度差值，以此值代表PMN的（MPO）酶活力的改變. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以x±s表示，2組各項(xiàng)參數(shù)均采用方差分析進(jìn)行比較.P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1LDH含量對(duì)照組大鼠肺灌洗液中可檢測(cè)到少量的LDH,但較血中明顯減少.實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段肺灌洗液中LDH顯著增加,與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01)，但各時(shí)間點(diǎn)的LDH差異不明顯.對(duì)照組大鼠血中可檢測(cè)到少量的LDH，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段血中LDH顯著增加,與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01),但各時(shí)間點(diǎn)間無明顯差異(T
7、ab1).表1ASP各時(shí)段MPO活性及血清LDH活性（略） 2.2肺通透指數(shù)和PMN凋亡實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段肺通透指數(shù)均明顯升高，與對(duì)照組比較有顯著性差異（Tab2）.對(duì)照組大鼠肺泡灌洗液中PMN的凋亡處于相對(duì)較高水平，各時(shí)間段無顯著差異.實(shí)驗(yàn)組大鼠肺泡灌洗液中PMN的凋亡明顯減少，與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.01,Tab2).表2肺泡灌洗液中PMN凋亡比率、LDH活性及肺通透指數(shù)（略） 2.3肺組織MPO活性實(shí)驗(yàn)組各時(shí)段與對(duì)照組相比，肺MPO活性均明顯升高，且各時(shí)段內(nèi)相互比較，肺MPO活性隨時(shí)間呈增加的趨勢(shì)，在12h段達(dá)到峰值(P<0.0
