無血清培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)擴增 cik細胞分泌細胞因子水平的比較論文

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1、無血清培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)擴增CIK細胞分泌細胞因子水平的比較論文【摘要】目的比較無血清培養(yǎng)基（AIMV）與完全培養(yǎng)基（CM）體外誘導(dǎo)擴增CIK細胞及CIK細胞分泌細胞因子水平。方法分別用AIMV及完全培養(yǎng)基加入4種細胞因子(IFNγ、IL2、IL1及OKT3)將臍帶血單個核細胞(CBMNCs)誘導(dǎo)成CIK細胞，比較細胞的增殖能力、細胞表型及分泌細胞因子水平。結(jié)果與完全培養(yǎng)基比較，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞增殖高峰較晚(14～17天),但增殖倍數(shù)高，在細胞表型、分泌細胞因子水平方面兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的

2、CIK細胞均無明顯的差別（P＞0.05）。結(jié)論無血清培養(yǎng)基可代替完全培養(yǎng)基?！娟P(guān)鍵詞】無血清培養(yǎng)基免疫細胞培養(yǎng)細胞因子腫瘤0引言CIK細胞（Cytokineinducedkiller，CIK）是將人外周血單個核細胞，在體外用多種細胞因子（如IFNγ、IL2、IL1及OKT3等）共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞。具有極強的增殖能力及殺傷腫瘤細胞的能力。Critzapis等1報道，CIK細胞分泌多種細胞因子進一步提高免疫效應(yīng)細胞的細胞毒作用從而殺傷腫瘤細胞。治療所需的CIK細胞在體外培養(yǎng)時所用的條件對細

3、胞的活性有很大影響。現(xiàn)在常用于細胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基,因含有人AB血清,雖經(jīng)HBV、HCV及HIV的檢測,但仍有可能傳播其他疾病,安全性低;并且存在批次差異、不宜質(zhì)控，質(zhì)量不能保證。無血清培養(yǎng)基則可達到生物潔凈要求,成分明確,質(zhì)量穩(wěn)定,便于質(zhì)控,克服了人ＡＢ血清的缺點,能減少病人意外感染的機會.freell(枸櫞酸鈉抗凝),產(chǎn)婦各項生化指標檢測正常。RPMI1640培養(yǎng)基、淋巴細胞分離液和無血清培養(yǎng)基購自GIBCO公司,.freelanColuter公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司。1.2方法1.2.1

4、細胞培養(yǎng)臍血用淋巴細胞分離液作密度梯度2500r/min離心30min分離的外周血單個核細胞,分別用完全培養(yǎng)基(RPMI1640,含10%胎牛血清,100μｇ/ｍｌ鏈霉素,100Ｕ/ｍｌ青霉素)和無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/ml,接種于24孔培養(yǎng)板,930μl/孔。第1天加入rhIFNγ1000u/ml,培養(yǎng)24h后加入rhIL2300u/ml、rhIL1100u/ml及OKT350ng/ml繼續(xù)培養(yǎng),每隔4d更換培養(yǎng)基,調(diào)細胞數(shù)為1×106個/ml,補加rhIL2300u/ml,每8d在補加

5、rhIL2的同時補加OKT350ng/ml。YTMLC、GLC和A549用含10%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640常規(guī)培養(yǎng)。設(shè)不加細胞因子的CBMNCs培養(yǎng)作為對照。1.2.2細胞表型分析于培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21d對以上各組效應(yīng)細胞進行分析,每組每次測4個復(fù)孔。1.2.3細胞增殖能力測定于培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞用臺盼藍拒染法計數(shù)所培養(yǎng)的活細胞濃度,根據(jù)流式檢測的CIK的比例，計量液量,推算CIK細胞總數(shù)。

6、1.2.4CIK細胞分泌IL2、IFNγ、TNFα細胞因子水平測定于培養(yǎng)的第0、4、8、10、12、14、17、21d分別取細胞,充分洗滌,調(diào)整細胞濃度為2×106/ml培養(yǎng)24ｈ后,收集上清,用ＥＬＩＳＡ法定量測定細胞培養(yǎng)上清中IL2、IFNγ、TNFα，設(shè)4個平行孔。2結(jié)果2.1ＡＩＭＶ與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細胞增殖能力的比較實驗表明,ＡＩＭＶ培養(yǎng)細胞較完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞增殖遲緩。完全培養(yǎng)基增殖高峰期在第12d，增殖平臺為第10～12d，最高增殖倍數(shù)為638.4倍；而ＡＩＭＶ培養(yǎng)基增殖高峰期在第

7、14d，增殖平臺為第14～17d，最高增殖倍數(shù)為678.7倍。雖然ＡＩＭＶ培養(yǎng)細胞較完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞增殖遲緩，但其增殖平臺期較長，增殖倍數(shù)較完全培養(yǎng)基高，見圖1。圖1AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CIK細胞增殖能力2.2ＡＩＭＶ與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞表型比較實驗結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+細胞所占百分比逐漸增多，CD3+CD56+細胞在ＡＩＭＶ培養(yǎng)基中，增長高峰在14～17d，所占相對百分率由（0.21±0.04）上升為（31.53±1.65）,增長了150.14倍，完全培養(yǎng)基

8、增長高峰在12～14d，所占相對百分率由（0.21±0.04）上升為（30.90±2.28），增長了147.14倍。對照組CBMNCs培養(yǎng)體系中未出現(xiàn)明顯的細胞表型轉(zhuǎn)化,各種細胞成分均呈遞減趨勢，見表1、圖2。2.3AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞分泌細胞因子水平2.3.1IL2水平AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞均分泌IL12，從第4d分泌量均穩(wěn)定升高，都于12d達到高峰