探討肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白spd0295的重組表達(dá)

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1、探討肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白SPD0295的重組表達(dá)　　肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是引起細(xì)菌性肺炎、中耳炎、菌血癥及腦膜炎等的主要致病菌，其在世界范圍內(nèi)有較高的致病率與死亡率，尤其是對嬰幼兒及老年人存在高致病性。目前，市售的S.pn疫苗主要有2大類，一類是以23價S.pn疫苗為代表的多糖疫苗，存在免疫原性和誘導(dǎo)非T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng)弱、對老年人及2歲以下兒童保護(hù)效果差等諸多缺點(diǎn)。而另一類則是以PCV7為代表的結(jié)合疫苗，在使用過程中存在莢膜血清型轉(zhuǎn)換、價格昂貴等缺點(diǎn);目前發(fā)現(xiàn)的93種S.pn血清型中，PCV疫苗覆蓋面極為有限，不能產(chǎn)生廣泛的

2、保護(hù)效應(yīng)。因此，開發(fā)成本低、免疫原性好、保守性高的S.pn蛋白疫苗，促進(jìn)S.pn疫苗更新?lián)Q代顯得尤為必要。磷酸烯醇丙酮酸依賴的磷酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(thephosphoenolpyruvatedependentphosphotransferasesystem，PTS)由非特異性酶I(EnzymeI，EI)、熱穩(wěn)定組氨酸蛋白(histidineprotein，HPr)和對糖有特異性的酶II(EnzymeII，EII)組成。該系統(tǒng)在多種革蘭陽性菌中具有轉(zhuǎn)運(yùn)碳源、趨化效應(yīng)、磷酸化作用以及對其它代謝通路的調(diào)節(jié)作用。其中EII由EIIA、EIIB及EIIC組成，而SPD0295是肺炎鏈球菌EII

3、B的核心組分，其對碳源具有特異性轉(zhuǎn)運(yùn)功能，可能是潛在的候選疫苗靶點(diǎn)，而目前國內(nèi)外關(guān)于該蛋白的研究很少。因此，本研究擬探討SPD0295重組蛋白的抗原性、其在不同S.pn菌株中的保守性及其對肺炎鏈球菌的黏附抑制效應(yīng)，為S.pn蛋白疫苗的開發(fā)提供初步理論依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1實驗材料　　所用6～8周齡、體質(zhì)量18～20g的雌性Balb/c小鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，并負(fù)責(zé)長期飼養(yǎng)。NCTC7466(D39)、TIGR4型S.pn標(biāo)準(zhǔn)菌株購自歐洲國家標(biāo)準(zhǔn)菌種庫;CMCC(B)31693(serotype19F)、CMCC(B)31446(serotype4)、CMCC

4、(B)31614(serotype14)、CMCC(B)31207(serotype6B)、CMCC(B)31436(serotype3)等臨床菌株，均由中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供;pET28a、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)均由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室長期保存;A549細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)生物工程系提供?；蚪MDNA抽提試劑盒、DNA純化試劑盒和Prime-Star高保真DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及XhoⅠ均由TaKaRa公司提供;DNAmarker從上海生物工程公司購進(jìn);6His標(biāo)簽抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗

5、體，均從北京中杉公司購進(jìn);質(zhì)粒抽提試劑盒為美國Omega公司提供;T4-DNA連接酶為美國Promega公司產(chǎn)品;硫代半乳糖苷為美國Sigma公司產(chǎn)品、鋁佐劑為美國Pierce公司產(chǎn)品;His-BindColumn(Ni-NTA)樹脂為美國GE公司產(chǎn)品?！　?.2目的基因　　擴(kuò)增-80℃冰箱取出S.pnD39標(biāo)準(zhǔn)菌株，室溫復(fù)蘇后取少量加于C+Y培養(yǎng)基中，37℃增菌培養(yǎng)至細(xì)菌生長到對數(shù)中、后期，按基因組DNA抽提試劑盒說明書提取全基因組DNA，PCR技術(shù)擴(kuò)增spd0295基因的開放讀碼框架(約492bp)。引物由上海生物有限公司合成，其中：上游引物P1：5′-GCCGG

6、AATTCATGACAATGCCAAATATT-3′，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn);下游引物P2：5′-GCGCTCGAGTTAAATATAGTCCATAATG-3′，含XhoⅠ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增體系為:ddH2O32.5μl、5buffer(含Mg2+)10.0μl、P1(10pmol/L)1.0μl、P2(10pmol/L)1.0μl、dNTP(10mmol/L)4.0μl、S.pn基因組DNA1.0μl、Prime-Star0.5μl共50μl，擴(kuò)增條件為：98℃10s、55℃15s、72℃40s，反應(yīng)

7、30個循環(huán);最后72℃延伸10min，取5.0μl產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定?！　?.3重組質(zhì)粒構(gòu)建　　分別用EcoRⅠ及XhoⅠ對上述純化后目的DNA和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后在T4-DNA連接酶作用下連接16h，然后轉(zhuǎn)化提前制備好的感受態(tài)細(xì)胞DH5α，鋪于含Kana抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單個菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)，同時進(jìn)行菌液PCR、雙酶切鑒定和送金斯瑞公司進(jìn)行測序鑒定。　　1.4目的蛋白的表達(dá)、純化及鑒定　　將構(gòu)建的SP