生物固氮作用的分子機(jī)理研究

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1、項(xiàng)目名稱：生物固氮作用的分子機(jī)理研究首席科學(xué)家：王憶平北京大學(xué)起止年限：2010年1月-2014年8月依托部門：教育部一、研究內(nèi)容生物固氮研究的關(guān)鍵科學(xué)問題是獲得最佳生物固氮體系（包括共生固氮、聯(lián)合（內(nèi)生）固氮等）和建立非豆科植物的自主固氮體系，具體包括：（1）闡明根瘤菌共生固氮基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，根瘤菌識(shí)別、傳遞環(huán)境和植物信號(hào)，調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)的分子機(jī)理；（2）揭示固氮及氮代謝基因調(diào)控機(jī)理，與碳代謝系統(tǒng)及其基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)制；（3）闡明共生固氮體系中植物與微生物相互作用的機(jī)理，如植物與微生物相互識(shí)別及分子信號(hào)的傳導(dǎo)機(jī)制，克服宿主特異性，

2、從而擴(kuò)大根瘤菌的宿主范圍；（4）利用單細(xì)胞真核生物--酵母菌的線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉(zhuǎn)化和表達(dá)的機(jī)制，為固氮基因向高等植物轉(zhuǎn)移，建立非豆科植物自主固氮體系的奠定基礎(chǔ)。（5）闡明固氮酶結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)理。圍繞上述提高生物固氮效率、擴(kuò)大共生固氮植物范圍、建立自主固氮體系的關(guān)鍵問題，主要研究內(nèi)容有：（1）以模式豆科植物共生固氮體系為材料，分離和鑒定參與根瘤菌結(jié)瘤因子信號(hào)傳遞的調(diào)控元件及基因，研究和建立根瘤菌與宿主植物共生關(guān)系蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)；通過對(duì)豆科植物與根瘤菌、AM真菌共生的異同以及與非豆科植物比較基因組學(xué)研究，揭示

3、非豆科植物中存在哪些與共生相關(guān)基因的功能及調(diào)控機(jī)制，為探索擴(kuò)大根瘤菌寄主范圍和建立非豆科共生固氮途徑可能性提供科學(xué)資料；分離和鑒定LysR、GntR等家簇轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因，闡明根瘤菌主代謝與共生固氮功能的相關(guān)性和調(diào)控機(jī)理；開展根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)及胞外多糖合成基因表達(dá)調(diào)節(jié)的雙組分調(diào)控系統(tǒng)的研究，闡明這些代謝系統(tǒng)在不同環(huán)境條件下的功能和作用機(jī)制，揭示根瘤菌環(huán)境適應(yīng)性與競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤之間的相關(guān)性。（2）碳代謝與氮代謝是自然界生命活動(dòng)的兩大主要代謝作用。固氮基因調(diào)控機(jī)理，以及碳代謝和氮代謝之間的調(diào)控偶聯(lián)途徑已經(jīng)得到了解析，但碳代謝對(duì)固氮

4、基因的表達(dá)的抑制機(jī)理與途徑有較大不同。因此，進(jìn)一步解析碳代謝調(diào)控系統(tǒng)對(duì)固氮基因的調(diào)控偶聯(lián)機(jī)理將為提高生物固氮效率打下理論基礎(chǔ)；建立酵母菌單細(xì)胞真核生物及其線粒體遺傳操作系統(tǒng)，探索固氮基因簇向真核生物轉(zhuǎn)化的可能和表達(dá)機(jī)制。包括：酵母菌線粒體遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建；線粒體鉬的運(yùn)輸、RNA聚合酶對(duì)固氮基因表達(dá)的影響（RNA聚合酶、s因子、DNA折疊蛋白等）；線粒體呼吸耗氧與固氮酶厭氧的關(guān)系和影響；線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間的氨基酸穿梭往返機(jī)制對(duì)生物固氮效果的影響等。以上研究是固氮基因向真核生物轉(zhuǎn)移的新的嘗試，為非豆科植物（包括糧食作物）建立自主的生物固氮體

5、系探索新路。（3）聯(lián)合固氮作用有三個(gè)重要的限制因子，即氧、銨和能量。其中，能量和銨又是導(dǎo)致目前田間聯(lián)合固氮效率低下的最主要限制因子。我們擬利用功能基因組操作平臺(tái)，對(duì)斯氏假單胞菌和巴西固氮螺菌等聯(lián)合固氮菌和上述主要限制因子，在聯(lián)合固氮微生物功能基因組、聯(lián)合固氮基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及固氮酶催化機(jī)制等開展工作。分析鑒定可能參與細(xì)菌氮信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控或保持最佳固氮水平的新基因和新機(jī)制，系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機(jī)理和聯(lián)合固氮微生物對(duì)土壤環(huán)境變化的適應(yīng)能力,探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的策略。（4）在固氮酶還原氮?dú)夂唾|(zhì)子的分子機(jī)制方面，利

6、用生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)化學(xué)理論，分析研究野生型及各突變株固氮酶還原N2和H+的動(dòng)力學(xué)、EPR、CD波譜等特征。明確N2的絡(luò)合和還原位置及其電子質(zhì)子傳遞通道。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)：本項(xiàng)目的總體目標(biāo)是借助分子生物學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)，開展生物固氮作用的分子機(jī)理研究，在分子水平上解析低等固氮微生物與高等植物宿主之間遺傳信息的交流；共生固氮體系的建立；固氮過程中能量及營養(yǎng)物質(zhì)的交換；固氮功能的發(fā)揮等關(guān)鍵科學(xué)問題。為擴(kuò)大根瘤菌宿主植物范圍、提高生物固氮效率，探索非豆科植物共生體系及自主固氮的可能性提供科學(xué)依據(jù)，為生物固氮在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)

7、支撐，緩解和減輕農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長期和大量依賴工業(yè)氮肥施用所造成的能源和環(huán)境問題，為保障我國糧食生產(chǎn)安全，農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的途徑。五年目標(biāo)：1）建立根瘤菌與宿主植物共生關(guān)系中蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分離和鑒定參與根瘤形成和發(fā)育功能基因及其調(diào)控蛋白，闡明根瘤菌共生信號(hào)在豆科植物中接受、傳遞及其調(diào)控的機(jī)制；建立豆科植物突變體庫，分離和鑒定與共生固氮相關(guān)的突變株；比較豆科植物與根瘤菌或AM真菌共生基因的異同，并比較非豆科植物基因組，闡明非豆科植物中存在哪些與共生固氮相關(guān)的基因及其功能、表達(dá)與調(diào)控機(jī)制。2）通過基因芯片等轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，分離和鑒定LysR和

8、GntR家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的下游靶基因，闡明其調(diào)節(jié)共生固氮作用的分子機(jī)理；通過定向缺失突變，分離和鑒定參與根瘤菌細(xì)胞周期調(diào)控以及共生固氮作用的激酶和反應(yīng)蛋白基因，并確定其相互作用網(wǎng)絡(luò)；分離和鑒定