鹽藻細(xì)胞dsrab蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

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1、精選公文范文管理資料鹽藻細(xì)胞DsRab蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化　　鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina，以下簡(jiǎn)稱鹽藻）的細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有很強(qiáng)的抗鹽能力，可以生長(zhǎng)在5.0mol/LNaCl培養(yǎng)液中，而且其培養(yǎng)條件也很簡(jiǎn)單。因此，鹽藻是研究植物耐鹽分子機(jī)制的重要模式生物。研究表明當(dāng)鹽藻在高鹽環(huán)境脅迫下，體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成和降解以及能量代謝等多種代謝途徑會(huì)發(fā)生很大程度的改變，其中耐鹽作用主要是依靠鹽藻中Na+/H+泵和大量合成兼容性溶質(zhì)甘油，但應(yīng)答鹽脅迫的調(diào)控過程還少有報(bào)道。從信號(hào)傳導(dǎo)方面開展對(duì)鹽藻抗鹽生理調(diào)節(jié)過程的研究，有助于全面了解鹽藻耐鹽機(jī)制?！　⌒蛋白（SmallGTP

2、-bindingproteins）分子量一般在20-30kD之間，以單體形式普遍存在于真核生物中，通過激活態(tài)（結(jié)合GTP）與非激活態(tài)（結(jié)合[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料GDP）的轉(zhuǎn)變來行使分子開關(guān)作用，參與重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，包括信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架重組等。Rab蛋白是小G蛋白家族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar和Ran5個(gè)亞家族）中最大的亞家族，近年來在酵母、果蠅、擬南芥、煙草、水稻等真核生物中發(fā)現(xiàn)的Rab蛋白遍布于胞內(nèi)的各個(gè)膜區(qū)室，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab蛋白定位于特定的細(xì)胞器膜上，參與膜泡的形成、定向轉(zhuǎn)運(yùn)、錨定鏈

3、接等過程?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多與植物的抗逆性有關(guān)的Rab蛋白，其表達(dá)量會(huì)受到鹽脅迫、低溫、干旱等逆境條件的影響。因此，深入了解Rab蛋白功能及進(jìn)一步研究植物抗逆性相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)具有重要科學(xué)意義?！　”緦?shí)驗(yàn)室已從鹽藻細(xì)胞中成功克隆出新的Rab蛋白基因DsRab（GenBankAccessionNo.JN989548），并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了DsRab基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況，證明DsRab是一個(gè)鹽誘導(dǎo)上調(diào)基因。本試驗(yàn)構(gòu)建重組表達(dá)載體pGS-21a-DsRab，通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件使[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料DsRab蛋白在上清中的表達(dá)量增加

4、，利用GST-SefinoseTMKit純化，獲得純度較高的可溶性融合蛋白，為制備抗體以及進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平上研究該蛋白在鹽藻耐鹽性機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)?！　?、材料與方法　　1.1材料　　1.1.1菌種和質(zhì)粒大腸桿菌（E.coli）菌株DH5α、E.coliBL21（DE3）、質(zhì)粒pGS-21a由本室保存；pMD18-TSimpleVector購(gòu)自TaKaRa公司?！　?.1.2試劑限制性內(nèi)切酶、Taq酶、IPTG、X-gal、T4連接酶購(gòu)自TaKaRa，硝酸纖維素膜、Anti-GSTAntibody、HRP-IgG、沉淀型單組分TMB底物溶液購(gòu)自TIANGEN，GST-Se

5、finoseTMKit（BSP032-7），Pr-estainedProteinMolecularWeightMarker購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?！　?.2方法　　1.2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料根據(jù)DsRab基因cDNA全長(zhǎng)序列（GenBankAccessionNo.JN989548）設(shè)計(jì)引物并加入酶切位點(diǎn)，上游引物（含EcoRI酶切位點(diǎn)）P1：5’-CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC-3’，下游引物（含SalI酶切位點(diǎn)）P

6、2：5’-GTCGA-CCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3’。以總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，P1，P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸9min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，回收目的片段，連接到pMD18-Tsimple載體上（T-A克?。?，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-DsRab，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，在Amp抗性平板上篩選陽(yáng)性單克隆。用EcoRI、SalI雙酶切目的片段和pGS-21a質(zhì)粒，用T4連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pGS-21a-DsRab，

7、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料感受態(tài)，篩選陽(yáng)性單克隆，交由大連寶生物公司測(cè)序，以驗(yàn)證讀碼框的正確性?！　?.2.2融合蛋白的原核表達(dá)將測(cè)序鑒定正確的表達(dá)質(zhì)粒pGS-21a-DsRab轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），挑取陽(yáng)性單克隆，接種于5mL含氨芐青霉素（50mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。次日，按1%的比例接種到5mL新的LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素50mg/L）中，37℃振蕩培養(yǎng)到菌液OD600=0.6-0.8時(shí)，試驗(yàn)組加