鹽藻細胞dsrab蛋白的誘導表達及純化

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1、精選公文范文管理資料鹽藻細胞DsRab蛋白的誘導表達及純化　　鹽生杜氏藻（Dunaliellasalina，以下簡稱鹽藻）的細胞結構簡單，具有很強的抗鹽能力，可以生長在5.0mol/LNaCl培養(yǎng)液中，而且其培養(yǎng)條件也很簡單。因此，鹽藻是研究植物耐鹽分子機制的重要模式生物。研究表明當鹽藻在高鹽環(huán)境脅迫下，體內的蛋白質合成和降解以及能量代謝等多種代謝途徑會發(fā)生很大程度的改變，其中耐鹽作用主要是依靠鹽藻中Na+/H+泵和大量合成兼容性溶質甘油，但應答鹽脅迫的調控過程還少有報道。從信號傳導方面開展對鹽藻抗鹽生理調節(jié)過程的研究，有助于全面了解鹽藻耐鹽機制?！　⌒蛋白（SmallGTP

2、-bindingproteins）分子量一般在20-30kD之間，以單體形式普遍存在于真核生物中，通過激活態(tài)（結合GTP）與非激活態(tài)（結合[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料GDP）的轉變來行使分子開關作用，參與重要的細胞生理活動，包括信號傳導、細胞增殖、囊泡轉運、細胞骨架重組等。Rab蛋白是小G蛋白家族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar和Ran5個亞家族）中最大的亞家族，近年來在酵母、果蠅、擬南芥、煙草、水稻等真核生物中發(fā)現(xiàn)的Rab蛋白遍布于胞內的各個膜區(qū)室，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab蛋白定位于特定的細胞器膜上，參與膜泡的形成、定向轉運、錨定鏈

3、接等過程?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多與植物的抗逆性有關的Rab蛋白，其表達量會受到鹽脅迫、低溫、干旱等逆境條件的影響。因此，深入了解Rab蛋白功能及進一步研究植物抗逆性相關蛋白的相互作用網(wǎng)絡具有重要科學意義?！　”緦嶒炇乙褟柠}藻細胞中成功克隆出新的Rab蛋白基因DsRab（GenBankAccessionNo.JN989548），并用實時熒光定量PCR方法研究了DsRab基因在鹽脅迫下的表達情況，證明DsRab是一個鹽誘導上調基因。本試驗構建重組表達載體pGS-21a-DsRab，通過優(yōu)化誘導表達條件使[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料DsRab蛋白在上清中的表達量增加

4、，利用GST-SefinoseTMKit純化，獲得純度較高的可溶性融合蛋白，為制備抗體以及進一步在蛋白質水平上研究該蛋白在鹽藻耐鹽性機制中的作用奠定基礎。　　1、材料與方法　　1.1材料　　1.1.1菌種和質粒大腸桿菌（E.coli）菌株DH5α、E.coliBL21（DE3）、質粒pGS-21a由本室保存；pMD18-TSimpleVector購自TaKaRa公司?！　?.1.2試劑限制性內切酶、Taq酶、IPTG、X-gal、T4連接酶購自TaKaRa，硝酸纖維素膜、Anti-GSTAntibody、HRP-IgG、沉淀型單組分TMB底物溶液購自TIANGEN，GST-Se

5、finoseTMKit（BSP032-7），Pr-estainedProteinMolecularWeightMarker購自生工生物工程（上海）有限公司，凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純?！　?.2方法　　1.2.1原核表達載體的構建[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料根據(jù)DsRab基因cDNA全長序列（GenBankAccessionNo.JN989548）設計引物并加入酶切位點，上游引物（含EcoRI酶切位點）P1：5’-CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC-3’，下游引物（含SalI酶切位點）P

6、2：5’-GTCGA-CCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3’。以總RNA反轉錄的cDNA為模板，P1，P2為引物進行PCR擴增。擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸9min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，回收目的片段，連接到pMD18-Tsimple載體上（T-A克隆），構建重組質粒pMD18-DsRab，轉化E.coliDH5α感受態(tài)，在Amp抗性平板上篩選陽性單克隆。用EcoRI、SalI雙酶切目的片段和pGS-21a質粒，用T4連接酶連接，構建表達載體pGS-21a-DsRab，

7、轉化E.coliDH5α[鍵入文字][鍵入文字][鍵入文字]精選公文范文管理資料感受態(tài)，篩選陽性單克隆，交由大連寶生物公司測序，以驗證讀碼框的正確性?！　?.2.2融合蛋白的原核表達將測序鑒定正確的表達質粒pGS-21a-DsRab轉化E.coliBL21（DE3），挑取陽性單克隆，接種于5mL含氨芐青霉素（50mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。次日，按1%的比例接種到5mL新的LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素50mg/L）中，37℃振蕩培養(yǎng)到菌液OD600=0.6-0.8時，試驗組加