第15章 核酸的研究方法

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1、第十五章核酸的研究方法第一節(jié)核酸的分離、提純和定量測(cè)定一、DNA的分離用1mol/L的NaCl制備組織勻漿，離心除去組織殘?jiān)?，多次用苯酚處理使蛋白質(zhì)變性，每次處理后離心取上層水相，最后加2倍體積的乙醇沉淀出DNA。二、RNA的分離由于RNA酶存在廣泛，且十分穩(wěn)定，破碎細(xì)胞時(shí)要加入胍鹽破壞RNA酶，試劑要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制，器皿要高壓滅菌或用0.1%的DEPC處理，多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變性，每次處理后離心取上層水相，mRNA可用寡聚dT-纖維素親和層析從總RNA中分離。三、核酸含量的測(cè)定法常用的方法是測(cè)定260

2、nm的消光度，用公式計(jì)算核酸的含量。核酸的含量也可以用定磷法測(cè)定。DNA的含量可以用二苯胺顯色法測(cè)定。RNA的含量可以用地衣酚顯色法測(cè)定。第二節(jié)核酸的超速離心及核酸的凝膠電泳一、核酸的超速離心超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大），線性DNA（密度?。┖烷]環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。二、核酸的凝膠電泳從細(xì)菌抽提得到的質(zhì)粒DNA樣品中不含線狀DNA第三節(jié)核酸的核苷酸序列測(cè)定一、DNA的酶法（末端終止法）測(cè)序二、DNA的化學(xué)法測(cè)序DNA酶法測(cè)序自動(dòng)化：使用4種熒光素標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，毛細(xì)管電泳和激光掃描技術(shù)使測(cè)序自動(dòng)化，一個(gè)泳道

3、一次可測(cè)大約1000個(gè)核苷酸，測(cè)序已成為可以快速完成的常規(guī)技術(shù)。人類基因組測(cè)序已經(jīng)完成，多態(tài)性的研究和功能基因組學(xué)已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。限制性酶切位點(diǎn)分析是繪制物理圖的常用方法。由于測(cè)序儀在一個(gè)泳道只能準(zhǔn)確測(cè)出幾百個(gè)核苷酸，對(duì)于長(zhǎng)DNA，只能將其切成小段再測(cè)序，為了組裝，需要確定足夠多的標(biāo)記位點(diǎn)。常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)等方法確定標(biāo)記位點(diǎn)。三、RNA的測(cè)序RNA的測(cè)序可以用4種特異性的酶切割（從胰臟提取的RNaseA水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的RNaseT1水解鳥苷酸的磷酸二酯

4、鍵，黑粉曲霉中提取的RNaseU2水解腺苷酸的磷酸二酯鍵，多頭黏菌中提取的RNasePhyI水解A、U、G三種核苷酸的磷酸二酯鍵），凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。也可以用化學(xué)試劑斷裂RNA鏈，用類似DNA化學(xué)測(cè)序的方法推斷核苷酸序列。最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DNA測(cè)序的方法推斷核苷酸序列。第四節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）一、PCR的定義PCR(polymerasechainreaction)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)之一，模板DNA的含量以指數(shù)方式增加，可用來(lái)快速在體外擴(kuò)增DNA，PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)和分子

5、生物學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。（二）復(fù)合PCR(multiplexPCR)?在同一反應(yīng)中用多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段的方法稱復(fù)合PCR。復(fù)合PCR主要用于同一病原體分型及同時(shí)檢測(cè)多種病原體。此外也常用于多點(diǎn)突變性分子病的診斷。?（三）不對(duì)稱PCR(asymmetricPCR)?兩種引物比例相差較大的PCR稱不對(duì)稱PCR。不對(duì)稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交的探針等。（四）反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR)?由于Taq酶只能以DNA為模板，當(dāng)待擴(kuò)

6、增模板為RNA時(shí)，需先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，在分子生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。?（五）涂片PCR(slide-PCR)?直接對(duì)載玻片上細(xì)胞涂片或組織切片進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法稱涂片PCR。涂片PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR檢測(cè)。（六）反向PCR(inversePCR)?擴(kuò)增引物相反方向DNA序列的PCR技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA片段進(jìn)行酶切和環(huán)化，然后直接進(jìn)行PCR，也可將已知序列酶切后再進(jìn)行PCR

7、。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴(kuò)增。（七）錨定PCR(anchoredPCR)?用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA3′端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。（八）修飾引物PCR?為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的如定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析物結(jié)合位點(diǎn)等，這種PCR技術(shù)稱為修飾引物PCR。此外，還可將一些信號(hào)分子如熒光素、生物素等連接于引物的5′末端，當(dāng)P

8、CR完成后可對(duì)產(chǎn)物直接進(jìn)行檢測(cè)。?PCR在生命科學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，已有不少專著可供讀者參考。第五節(jié)DNA的化學(xué)合成固相磷酰亞胺法合成時(shí)，末端核苷酸的3′-OH與固相載體成共價(jià)鍵，5′-OH被