第15章 核酸的研究方法

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1、第十五章核酸的研究方法第一節(jié)核酸的分離、提純和定量測定一、DNA的分離用1mol/L的NaCl制備組織勻漿，離心除去組織殘渣，多次用苯酚處理使蛋白質(zhì)變性，每次處理后離心取上層水相，最后加2倍體積的乙醇沉淀出DNA。二、RNA的分離由于RNA酶存在廣泛，且十分穩(wěn)定，破碎細胞時要加入胍鹽破壞RNA酶，試劑要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制，器皿要高壓滅菌或用0.1%的DEPC處理，多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變性，每次處理后離心取上層水相，mRNA可用寡聚dT-纖維素親和層析從總RNA中分離。三、核酸含量的測定法常用的方法是測定260

2、nm的消光度，用公式計算核酸的含量。核酸的含量也可以用定磷法測定。DNA的含量可以用二苯胺顯色法測定。RNA的含量可以用地衣酚顯色法測定。第二節(jié)核酸的超速離心及核酸的凝膠電泳一、核酸的超速離心超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大），線性DNA（密度?。┖烷]環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。二、核酸的凝膠電泳從細菌抽提得到的質(zhì)粒DNA樣品中不含線狀DNA第三節(jié)核酸的核苷酸序列測定一、DNA的酶法（末端終止法）測序二、DNA的化學法測序DNA酶法測序自動化：使用4種熒光素標記的雙脫氧核苷酸，毛細管電泳和激光掃描技術使測序自動化，一個泳道

3、一次可測大約1000個核苷酸，測序已成為可以快速完成的常規(guī)技術。人類基因組測序已經(jīng)完成，多態(tài)性的研究和功能基因組學已經(jīng)成為研究的熱點。限制性酶切位點分析是繪制物理圖的常用方法。由于測序儀在一個泳道只能準確測出幾百個核苷酸，對于長DNA，只能將其切成小段再測序，為了組裝，需要確定足夠多的標記位點。常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標簽位點(STS)、表達序列標簽(EST)等方法確定標記位點。三、RNA的測序RNA的測序可以用4種特異性的酶切割（從胰臟提取的RNaseA水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的RNaseT1水解鳥苷酸的磷酸二酯

4、鍵，黑粉曲霉中提取的RNaseU2水解腺苷酸的磷酸二酯鍵，多頭黏菌中提取的RNasePhyI水解A、U、G三種核苷酸的磷酸二酯鍵），凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。也可以用化學試劑斷裂RNA鏈，用類似DNA化學測序的方法推斷核苷酸序列。最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DNA測序的方法推斷核苷酸序列。第四節(jié)聚合酶鏈反應（PCR）一、PCR的定義PCR(polymerasechainreaction)是應用最廣的分子生物學技術之一，模板DNA的含量以指數(shù)方式增加，可用來快速在體外擴增DNA，PCR技術在臨床檢驗和分子

5、生物學中的應用十分廣泛。耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動了這一技術的廣泛應用。（二）復合PCR(multiplexPCR)?在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段的方法稱復合PCR。復合PCR主要用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體。此外也常用于多點突變性分子病的診斷。?（三）不對稱PCR(asymmetricPCR)?兩種引物比例相差較大的PCR稱不對稱PCR。不對稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交的探針等。（四）反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR)?由于Taq酶只能以DNA為模板，當待擴

6、增模板為RNA時，需先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進行PCR擴增，這種PCR技術稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，在分子生物學和臨床檢驗等領域均有廣泛應用。?（五）涂片PCR(slide-PCR)?直接對載玻片上細胞涂片或組織切片進行PCR擴增的方法稱涂片PCR。涂片PCR結合原位雜交技術特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR檢測。（六）反向PCR(inversePCR)?擴增引物相反方向DNA序列的PCR技術稱反向PCR。在反向PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA片段進行酶切和環(huán)化，然后直接進行PCR，也可將已知序列酶切后再進行PCR

7、。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴增。（七）錨定PCR(anchoredPCR)?用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA3′端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結合位點對該cDNA進行PCR擴增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構建。（八）修飾引物PCR?為達到某些特殊應用目的如定向克隆、定點突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位點、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析物結合位點等，這種PCR技術稱為修飾引物PCR。此外，還可將一些信號分子如熒光素、生物素等連接于引物的5′末端，當P

8、CR完成后可對產(chǎn)物直接進行檢測。?PCR在生命科學中的應用非常廣泛，已有不少專著可供讀者參考。第五節(jié)DNA的化學合成固相磷酰亞胺法合成時，末端核苷酸的3′-OH與固相載體成共價鍵，5′-OH被