非洛地平對oxldl損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧

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1、非洛地平對oxLDL損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞一氧【摘要】目的探討非洛地平對氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA及一氧化氮(NO)表達(dá)的影響。方法將原代細(xì)胞分為空白對照組、oxLDL(6、12.5、25mg/L)損傷組、非洛地平(0.1、1.0、10μmol/L)+oxLDL(25mg/L)干預(yù)組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測eNOS、iNOS的mRNA水平，硝酸還原酶法測定培養(yǎng)上清中NO的濃度。結(jié)果oxLDL損傷內(nèi)皮細(xì)胞后，eNO

2、S、iNOSmRNA及NO較空白對照組升高;非洛地平下調(diào)oxLDL損傷的內(nèi)皮細(xì)胞iNOS的表達(dá)，增加其NO的生成。結(jié)論非洛地平可抑制低濃度oxLDL誘導(dǎo)的iNOSmRNA表達(dá)，增加NO的生成，發(fā)揮其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。【關(guān)鍵詞】非洛地平;一氧化氮合酶;一氧化氮;動(dòng)脈粥樣硬化ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsoffelodipineonmRNAlevelsofendothelialnitricoxidesynthase(eNOS)andinduciblenitricoxi

3、desynthase(iNOS)asonoxidum(NO)fromhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVECs)injuryedbyoxidizedlog/L),andinterventiongroupoffelodipine(0.1,1.0and10μmol/L)+oxLDL(25mg/L).TheneNOSandiNOSexpressionseasuredbyrealtimepolymerasechainreactionandthelevelofNOinthesupernatantsofthe

4、culturesethod.ResultsThemRNAexpressionsofeNOSandiNOSinHUVECsandNOlevelinthesupernatantsduringtreatmentechanismmayberelatedtoitsloRNAexpressionofiNOSinducedbyloonoxidum;atherosclerosis　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)在As的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。內(nèi)源性一氧化氮(NO)主要是由

5、血管內(nèi)皮細(xì)胞在一氧化氮合酶(NOS)的作用下產(chǎn)生的，內(nèi)皮受損后，NO的合成、釋放功能障礙導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性的舒血管反應(yīng)降低，促進(jìn)As的形成[1]，其機(jī)制涉及NOS的基因調(diào)控和活性調(diào)節(jié)[2]。NOS可分為內(nèi)皮型(eNOS)和誘生型(iNOS)，eNOS在正常條件下存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，保證NO的基礎(chǔ)釋放;生理?xiàng)l件下iNOS蛋白無活性表達(dá)，病理狀態(tài)下產(chǎn)生大量NO引起細(xì)胞毒作用，故又稱為病理型NOS。近年來，鈣通道阻滯劑獨(dú)立于降壓以外的多效作用備受關(guān)注，其中抗As作用尤其受到重視。非洛地平(felodipine)是長效二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，已作為高

6、血壓病的首選藥物在臨床廣泛應(yīng)用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，非洛地平可減輕高脂飲食喂養(yǎng)的兔主動(dòng)脈粥樣硬化病變。本研究試從細(xì)胞水平及NOSNO角度進(jìn)一步探討其內(nèi)皮保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1標(biāo)本本實(shí)驗(yàn)選用原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)，標(biāo)本來自于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠娩出的新生兒臍帶。于無菌條件下剪下臍帶放入無菌容器中，3h內(nèi)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng);置于50mL/LCO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育，待原代培養(yǎng)細(xì)胞生長至8

7、0%～90%融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng);將原代和傳至第3代的內(nèi)皮細(xì)胞懸液接種于蓋玻片上，進(jìn)行Ⅷ因子相關(guān)抗原的檢測;第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)?！　?.2oxLDL的制備采用一次性密度梯度超速離心法分離LDL。血漿在密度梯度液中，于4℃、50000r/min離心5h;分離出的LDL在4℃的LDL透析液中透析36h，在無EDTA的PBS中4℃透析36h;加入含CuSO4的PBS液，37℃氧化18h，并于4℃避光保存，備用。采用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定LDL和oxLDL的純度，并用硫代巴比妥酸反應(yīng)法確定其氧化修飾程度。　　1.3主要試劑M199培養(yǎng)基購自GIBC

8、O公司;胎牛血清購自杭州四季青生物研究所;非洛地平原粉、溶劑二甲亞砜(DMSO)購自Sigma公司;總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)