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1、Lipstatin高產(chǎn)菌株篩選【摘要】以毒三素鏈霉菌XC-lp-2的變株OT-3為出發(fā)菌株，經(jīng)UV和微波復(fù)合誘變處理，并在含豆油的平板上定向篩選耐豆油突變株，獲得了高產(chǎn)突變株XC-lp-69，其lipstatin發(fā)酵效價(jià)達(dá)到911μg/ml，較出發(fā)菌株OT-3提高了71.6%。傳代試驗(yàn)表明突變株XC-lp-69的高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定。【關(guān)鍵詞】Lipstatin；菌種選育；誘變；毒三素鏈霉菌ABSTRACTAfterStretomycestoxytriciniOT-3icroutantsl,orethanthatofthestartingstainOT-3.Thesubcultu
2、reexperimentsindicatedthatthehereditarycharacterofhighproductivityofstrainXC-lp-69isstable.KEYgSO4·7H2O1.0，自來(lái)水配制，pH7.0～7.2。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)冷榨黃豆餅粉30.0，甘油20.0，大豆卵磷脂12.0，酵母粉10.0，豆油5.5，自來(lái)水配制，pH7.0～7.2。1.3培養(yǎng)條件(1)斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度(30±0.5)℃，相對(duì)濕度35%～50%，培養(yǎng)時(shí)間120～150h。(2)種子培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度27℃，250ml三角瓶裝量25ml，轉(zhuǎn)速240r/min
3、，培養(yǎng)時(shí)間20～24h。(3)發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度27℃，250ml三角瓶裝量25ml，轉(zhuǎn)速240r/min，培養(yǎng)時(shí)間120h。1.4誘變處理(1)紫外線照射將單孢子懸浮液置紫外誘變箱(紫外燈功率30照射垂直距離30cm)中誘變處理一定時(shí)間，用黑布包好，在紅燈下用無(wú)菌水做梯度稀釋后涂布平板，30℃避光培養(yǎng)5～6d，挑單菌落傳斜面。(2)微波處理將單孢子懸浮液置于滅菌10ml試管中，在500ml燒杯中冰??；然后將冰浴燒杯連同試管放入800l，4000r/min離心15min，上清液用丙酮1∶4的比例稀釋搖勻浸泡1h，取上清液再次10000r/min離心3min或膜過濾，取清液進(jìn)
4、行HPLC測(cè)定胞外效價(jià)，并用同樣的方法測(cè)定菌絲體沉淀中的產(chǎn)物量(胞內(nèi)效價(jià))。本文中發(fā)酵效價(jià)為胞內(nèi)外效價(jià)之和。HPLC色譜條件色譜柱C18ODS(4.6mm×250mm，5μm)，柱溫35℃，檢測(cè)器DAD(HP1100)，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，流動(dòng)相為乙腈∶水(86∶14)，流速0.8ml/min。(2)pH測(cè)定用酸度計(jì)測(cè)定。(3)菌絲濃度測(cè)定取10ml發(fā)酵液，4000r/min離心15min，測(cè)定沉淀物在發(fā)酵液中所占比例作為菌絲濃度。2結(jié)果與討論2.1出發(fā)菌株的選擇取4℃冰箱保存的10株菌(XC-lp-2經(jīng)多次自然分離或其他誘變處理，經(jīng)不同模型選擇的較優(yōu)菌株)，連續(xù)發(fā)酵三批，其
5、結(jié)果平均值見表1。由表1可以看出OT-3菌株lipstatin發(fā)酵效價(jià)較高，因此選擇OT-3為出發(fā)菌株。2.2紫外線誘變處理結(jié)果試驗(yàn)中對(duì)出發(fā)菌株OT-3進(jìn)行不同劑量的UV誘變處理，經(jīng)梯度稀釋后涂布平板，待菌落生長(zhǎng)成熟后，從每個(gè)處理劑量平板中挑取30個(gè)單菌落分別傳斜面，逐一接種發(fā)酵瓶，考察誘變株的發(fā)酵水平，統(tǒng)計(jì)其致死率、變異率(±10%以上)和正變率，所得結(jié)果見表2。由表2可知，隨紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率、變異率相應(yīng)增加，但正變率較高出現(xiàn)在偏低劑量(60s)，這與有關(guān)報(bào)道〔4〕一致，故后續(xù)試驗(yàn)中均采用UV照射60s。經(jīng)多次UV誘變選得菌株OT-63，較出發(fā)菌株OT-3效價(jià)提
6、高20%，達(dá)到636μg/ml。2.3微波誘變處理結(jié)果試驗(yàn)中對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行了不同時(shí)間的微波照射處理，稀釋涂平板，待菌落成熟后轉(zhuǎn)接斜面，搖瓶發(fā)酵考察。統(tǒng)計(jì)致死率、正突變率和產(chǎn)量的最大提高率，結(jié)果見表3。由表3可以看出，隨著微波照射時(shí)間的延長(zhǎng)致死率上升，正變率下降，但產(chǎn)量最大提高率隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升，故后續(xù)試驗(yàn)采取微波照射7min。以O(shè)T-63為出發(fā)菌株，進(jìn)行微波誘變，微波處理后的孢子懸浮液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于分離平板，待菌落成熟后，挑單菌落傳斜面，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩和復(fù)篩。得到高產(chǎn)菌株,PaulB.Olistatat〔J〕.Drugs,1998,56(2):241〔2〕MeliaAT
7、,ZhiJ,ZelaskoR,etal.Theinteractionoftheliposeinhibitororlistatacol,1998,54(9～10):773〔3〕HollanderPA,ElbeinSC,HirschIB,etal.Roleoforlistatinthetreatmentofobesepatientssinthelipaseinhibitorlipstatin〔J〕.JBiolChem,2000,275(28):21192〔6〕MarkusG,,2001,66(13):466
