山大生化實驗報告實驗一、三酵母rna的提取和含量測定

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1、酵母RNA的提取和含量測定姓名：周超學號：201100140067班級：11級生命基地同組者：劉炳煜時間：2011年3月26fl【實驗目的】1.掌握稀間法提取酵母RXA的原理和方法2.了解測量核算濃度的不同方法的原理3.掌握紫外吸收法測定核酸濃度的原理和技術4.學會使用紫外分光光度計5.學會使用離心機【實驗原理】1.酵母RNA提取的原理：(1)酵母核酸屮RNA含量較多，DNA則少與2%(2)RNA可溶于堿性溶液，當堿被中和后，可加入乙醇使其沉淀，由此可制得粗RNA制品。(3)用堿提取的RNA有不同程度的降解

2、。2.紫外吸收法測RNA含量的原理：(1)核酸具冇吸收紫外線的性質，在波長260nm處有最大吸收，且在一定濃度范圍內光吸收值與濃度成止比(5-45ug/ml),符合朗伯■比爾定律。(2)優(yōu)點：操作簡單，樣品用量少，不用顯色，測完后樣品可以繼續(xù)使用。(3)缺點：當有大分子物質存在吋，也會有一定的吸收，會影響測量精確度?！緦嶒炘噭?.提取試劑：0.2%NaOH溶液酸性乙醇：5ml濃HC1加入到500ml95%乙醇中混勻95%乙醇無水乙醇1.含量測定試劑：0.2%NaOII溶液pH試紙(1-14)標準核酸：20

3、0ug/ml待測樣品核酸【實驗步驟】(1)將4g干酵母粉放入200ml錐形瓶中,加入40ml0.2%的NaOH溶液混勻。(2)沸水浴30min,然后用流水冷卻(3)4000轉/分離心15秒，保留上清液(4)在上清液中加入40ml酸性乙醇，邊加邊攪拌，靜置5分鐘左右，再4000轉/分離心5分鐘，保留沉淀(5)用20ml95%乙醇分兩次洗滌沉淀，每次洗后3000轉/分離心5分鐘(6)用20ml無水乙醇分兩次洗滌，每次洗后3000轉/分離心5分鐘(7)收集沉淀于濾紙上備用。2.RNA含量的測定：(1)準確稱取0.

4、2-0.25g(因提取到的RNA粗品量太少，本次實驗使用的R7A量僅為0.1910g)樣品核酸,加2ml0.2%NaOH溶液和lml水溶解，調成糊狀(2)再加入50ml左右的水溶解，邊溶解邊傳移到100ml燒杯屮，用0.2%NaOH調至中性，定容至100ml(3)再分3次取2.5n)l定容至100ml備用，做平行實驗(4)取200ug/ml的標準RXA20ml,加水定容至100ml,得到40ug/ml的RNA備用(5)再將40ug/ml的RNA按表一加樣稀釋，得到5ug/ml>10ug/ml>20ug/ml

5、>30ug/ml>40ug/ml的標準溶液(6)用紫外分光光度計測量吸光值，繪制標準曲線，計算樣品純度?！緦嶒灲Y果】表一管號標準曲線樣品012345678標準RNA(40ug/ml)/ml02.55101520//水/ml2017.5151050///標準RNA濃度/(ug/ml)0510203040//01)值00.0970.1910.3830.6210.7670.6380.6480.638圖一標準曲線標準曲線y=0.0196X計算：三次平行實驗平均0D值=0.6413,根據標準曲線，得到稀釋后的RNA濃

6、度為32.719ug/ml,則樣品RNA的純度為(32.719*40*100)/(0.1910*10”)=0.6852【思考討論】實驗結果分析：本次實驗最終的測定結杲為，RNA的純度為6&52%,造成這個結杲的原因：(1)用稀堿法提取的RNA有不同程度的降解(2)人在操作過程屮，會呼出少量的RA酶，也會降解樣品RNA,導致純度下降。(3)提取的樣品屮冇細胞內含物，也會對純度冇影響。注意事項：(1)離心機使用的注意事項：離心時，離心管要平衡對稱放置，既耍位置對稱,又要重量平衡。否則會造成離心機損壞。(2)提

7、取RA吋，用酒精沉淀吋，一定要充分，邊加酒精邊攪拌上清液。(3)提取RXA時，用酒精洗滌沉淀時，一定要把酒精與沉淀混勻，這樣做有利丁?增高捉取濃度。(4)RNA含量測定中，若RNA樣品少與2.0g時，取2.5ml的母液，定容至100ml；若RM樣品量為2.0-2.5g,則取2.0ml的母液，定容至100ml,這樣稀釋之后,可以保證測量液的吸光值在標準曲線之內。(5)使用紫外分光光度計測量RXA含量時，一定要注意做平行實驗，即分別取3次2.0ml的母液，分別定容至100ml,制成3個測量液，切記平行實驗不是

8、把相同的測量液測三次。