酵母RNA含量測定

《酵母RNA含量測定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、realtimeRT-qPCR是檢測樣本中特定基因表達量的有效方法，包含逆轉(zhuǎn)錄步驟和定量PCR步驟。好的開始是成功的一半，獲得高質(zhì)量的、能正確反應樣品中轉(zhuǎn)錄情況的RNA，對于其后的定量結(jié)果，自然是非常重要的。MikaelKubista，教授,R&DTATAABiocenter主任：RNA質(zhì)量包含兩個方面：樣品的純度和RNA的完整性。樣品純度可以在樣品稀釋時得到改善。我們通常通過Nanodrop測量吸光值來檢測純度。260/280吸光值的比率應該在2至2.1的范圍內(nèi)，并且是“漂亮”的吸光光譜曲線。

2、230nm吸收峰應該低。我們通過利用Experion(Bio-Rad)記錄電泳圖（electropherogram）檢測RNA的質(zhì)量。當然，最理想的結(jié)果是得到很清晰的18S和28S峰值。但RNA的完整性是無法改善的，保存樣品、固定樣品和來源于富含降解酶的器官的樣品RNA完整性通常不好。檢測RNA質(zhì)量的兩個原因，一是想要知道某一個實驗得到的RNA質(zhì)量，從而選擇適當?shù)腞T-qPCR方法，二是識別出研究中的樣品的質(zhì)量是否比正常情況差，避免導致偏差或者不正確的結(jié)果。JoVandesompele，根特大學

3、醫(yī)院（GhentUniversityHospital）醫(yī)學遺傳學中心高質(zhì)量的RNA應該是完整的、不含抑制劑的。我們習慣利用毛細管凝膠電泳系統(tǒng)來評價28S和18S條帶的比率，過程很快速并且只需要很少量的RNA。值得注意的是，這個比率是組織或者細胞特異的，所以理想的是你應該將樣品與一個同樣細胞來源的完整對照比較。在芯片分析（微陣列研究）中通常都要求進行RNA質(zhì)量分析，現(xiàn)在許多定量PCR領域的人們開始考慮RNA質(zhì)量這個因素。我們最近在發(fā)表的文章說到評價用于PCR分析的RNA的質(zhì)量尤為重要，這是由于并非

4、每個基因降解水平都相同，嚴重時甚至可以使你的實驗結(jié)果出錯(Perrez-Novoetal.,2005)。我們主要的結(jié)論是：參考基因(referencegene)的穩(wěn)定性在完整樣品（intact）和在降解樣品中是有差別的，因此你不應該將完整的樣品和降解的樣品相比，尤其是你在研究精確的表達差異時。檢測核糖體吸收峰值是目前評價RNA完整性的金標準，但其實rRNA僅是mRNA成分完整性的一個代言標記。我們開發(fā)了一種基于PCR的分析實驗，可以比較一個特定基因的5'和3'端amplicons的比率。通過比較

5、未知樣品和完整的對照樣品的比率，我們能夠利用PCR分析實驗衡量mRNA的完整性，與電泳評估/rRNA評估相比更具有直接相關性。為了評價制備RNA的純度（例如沒有抑制劑），我們實行qPCRSPUD分析，既簡單易用又免費(Nolanetal.,AnalBiochem,inpress).TimHunter，英國倫敦大學學院（UCL）：你需要建立靈活的操作流程來分離高質(zhì)量的RNA。樣品類型決定著哪一種分離方法是最好的。通常，初步的質(zhì)量監(jiān)控檢查是在NanoDrop分光光度計進行核酸定量的時候，260吸收峰

6、外的讀數(shù)值可指示污染情況。260/280的比率應該在1.8至2.1的范圍內(nèi)。同樣非常關鍵的，是要保證實驗所用的RNA質(zhì)量（全長、完整性）不打折扣，因此，我們通常利用Agilent2100Bioanalyzer檢查RNA的完整性，并根據(jù)rRNA峰值的完整性判斷RNA樣本的情況，選擇下一步實驗適合的方法。假如有證據(jù)顯示重要樣品有降解，我們會同時檢測一個在該樣品中已知穩(wěn)定的管家基因，來觀察是否出現(xiàn)由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不完整而導致管家基因在這個樣本中的表達改變。當探針并非處于外顯子—外顯子邊界時，我們會同時選擇

7、中/高表達的管家基因作(-)RT對照，以檢查基因組DNA的污染情況。樣品可在37oC下孵育2-4小時，并重新在Bioanalyze上分析降解情況，以檢查核酸酶的活性CristinaHartshorn,美國Brandeis大學生物學系：我認為高質(zhì)量RNA是指正確代表細胞內(nèi)容物的轉(zhuǎn)錄池（transcriptpool）的RNA。我們實驗室非常注重RNA的回收率，尤其是來源于像單個細胞等的微量樣品中RNA的純化，需要盡量減少可能導致核酸降解的操作步驟。因此，我們開發(fā)了一種能在同一支試管里連續(xù)進行收集細胞

8、、裂解細胞、去除蛋白雜質(zhì)、逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR等操作的整體流程。這種整個實驗在單個試管內(nèi)進行的方法稱為PurAmp(Hartshornetal.,2005a;Hartshornetal.,2005b)，該方法基于稀釋法，并且不需要將RNA結(jié)合到任何純化基質(zhì)上去，因此保證了實質(zhì)上純化得到完整的RNA庫。此外，我們覺得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完全去蛋白化對于RT引物與模板的正確結(jié)合、以及最終模版定量的精確性和可重復性來說是十分必要的，這就像對基因組DNA模板制備來說是必需的一樣。PurAmp方法有時要求一個DN