地氟醚預處理對缺氧%2f復氧損傷內皮細胞的保護作用及其分子機制

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1、論文獨創(chuàng)性聲明本論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機構已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻均已在論文中作了明確的聲明并表示了謝意。作者簽名：論文使用授權聲明日期：恥本人完全了解復旦大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱；學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨热?，可以采用影印、縮印或其它復制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。?名：珥一名：掣魄硼7．6I．．b復旦大學博士學位論文中文摘要地氟醚預處理對缺氧／復氧損傷內皮細

2、胞的保護作用及其分子機制中文摘要第一部分地氟醚預處理對缺氧，復氧損傷內皮細胞的保護作用目的了解缺氧，復氧(A／R)對人內皮細胞的損傷作用，和地氟醚預處理對內皮細胞的A／R損傷所起的保護作用。方法選用人臍靜脈內皮細胞株(ECV304)。將細胞分為5組：空白對照組(C組)，A／R組，．AIR+腫瘤壞死因子噸(TNF-a，10ng／m1)刺激組(A／R+TNF．a(chǎn)組)，地氟醚1．OMAC預處理+A／R組(Des+MR組)，地氟醚1．OMAC預處理+A／R+TNF．a(chǎn)(10rig／nil)刺激組(Des+A／R+TNFm組)。應用流式細胞儀碘化丙啶(PI)染色法、原位缺口末端標

3、記(TUNEL)法、透射電鏡(EM)觀察法檢測各組內皮細胞的凋亡和壞死。結果A／R組較對照組中的細胞凋亡和壞死率有一定增加；經(jīng)TNF-Q刺激后，A／Il+冊盯．a(chǎn)組的細胞凋亡和壞死率則顯著增加；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+MR組、Des+刖R十TNF．a(chǎn)組細胞較相應無預處理的A瓜組、A瓜+腫．a(chǎn)組，其細胞凋亡和壞死率有明顯減少；透射電鏡觀察到，刖R組和A／R+n師噸組，可見較多的細胞壞死現(xiàn)象：細胞腫脹、細胞內超微結構破壞，大量空泡出現(xiàn)，核染色質溶解或核碎裂、細胞膜破壞明顯。而兩組地氟醚預處理后的細胞結構正常，胞內有豐富的內質網(wǎng)和線粒體，核仁增多明顯，細胞處于增殖和修復狀

4、態(tài)。結論地氟醚預處理可抑制內皮細胞缺氧／復氧引起的細胞死亡、減少細胞損傷、加強細胞修復和增殖，從而具有一定的保護作用。關鍵詞地氟醚；預處理；靜脈內皮細胞；缺氧／復氧損傷；細胞凋亡復旦大學博士學位論文中文摘要第二部分地氟醚預處理對缺氧，復氧損傷內皮細胞中NF-v．B轉導通路的影響目的探討預處理對內皮細胞NF．r．B活性的影響；并進一步分析NF-r．B信號通路中一系列關鍵轉導蛋白表達的變化，以明確地氟醚預處理對內皮細胞A／R損傷所起保護作用的分子機制，為臨床麻醉實施中預防缺血再灌注損傷的麻醉藥物選擇提供實驗和理論依據(jù)。方法選用人臍靜脈內皮細胞株(ECV304)。將細胞分為5

5、組：空白對照組(C組)，A／R組，A／R+腫瘤壞死因子．n(n師．a(chǎn)，10ng／m1)刺激組(A／R+TNF．a(chǎn)組)，地氟醚1．0MAC預處理+A瓜組(I)es+A／R組)，地氟醚1．OMAC預處理+A／R+TNF．a(chǎn)00ng／Inl)刺激組(Des+A／R+TNF-a組)。采用間接免疫熒光法檢測各組細胞中NF．r,B／p65亞基的定位；應用核漿分離技術和Westernblot分析法檢測NF．心／p65亞基在各組細胞核內的蛋白表達水平；應用Westernblot分析法檢測各組細胞NF．逋信號途徑中，rd3抑制因子噸(IxB-a)的降解以及磷酸化IxB．Or,(p-It．

6、B-a)、磷酸化Ir．B激酶“B(p-IKKo／IKKI})的表達；以腫瘤壞死因子受體1(TNFRl)抗體免疫共沉淀(Co．Immunoprecipitation)并用Westernblot法檢測各組細胞膜受體信號轉導復合體中，TNFRl與腫瘤壞死因子受體相關因子2(tumornecrosisfactorreceptor．a(chǎn)ssociatdfactor2，TRAF2)及Ir．B激酶n(IKKn)的蛋白結合水平；應用流式細胞術檢測各組內皮細胞膜表面TNFRl的表達。結果間接免疫熒光分析法顯示對照組細胞NF．1d8／p65亞基免疫熒光標記分布于胞漿區(qū)；A／R組可見部分免疫熒

7、光標記由胞漿區(qū)轉入核區(qū)；經(jīng)TNF-o[刺激后，A／R+TNF-a組細胞的NF-r,B／p65亞基免疫熒光標記幾乎全部入核；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+A／R組的免疫熒光標記入核較A／R組有明顯減少；Des+A／R+TNF．a(chǎn)組的免疫熒光標記的入核亦較相應的A爪+1NF-a組有明顯減少。應用核漿分離技術、Westernblot分析法定量檢測，進一步確證了免疫熒光分析法的結果。Westernblot分析法檢測各組細胞中IrBa含量，可見A／R組較對照組Ir．Ba有一定減少；經(jīng)n師噸刺激后，可見顯著減少；而經(jīng)地氟醚預處理后，Des+A／R組較A