caspase-3,8,9在萊菔硫烷誘導(dǎo)人腺樣囊性癌細(xì)胞系acc-m凋亡中的作用

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1、河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文Caspase--3,8,9在萊菔硫烷誘導(dǎo)人腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC--M凋亡中的作用姓名：岳磊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：張英懷；王維麗201203中文摘要Caspase-3，8，9在萊菔硫烷誘導(dǎo)人腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M凋亡中的作用摘要目的：涎腺腺樣囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC)是口腔頜面部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居涎腺惡性腫瘤的第二位。嗜神經(jīng)浸潤(rùn)性和易發(fā)生血行性轉(zhuǎn)移是涎腺腺樣囊性癌的主要特征。其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，因此有必要以調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為靶點(diǎn)研究

2、腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，探索新的治療方法，提高患者的生存質(zhì)量和生存率。Caspase的全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是從十字花科類植物中提取的一種異硫氰酸酯，因其抗腫瘤效果佳而受到廣泛關(guān)注。Caspase家族成員在腫瘤，缺血再灌注，炎癥，組織損傷等過(guò)程中參與了多種細(xì)胞的凋亡，Caspase是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。我們近期的研究表明，SFN可以抑制腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC．M的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。但是在SFN誘導(dǎo)ACC．M細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Caspase．3，8，9所起的作用，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道

3、。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)體外培養(yǎng)的人腺樣囊性癌ACC．M細(xì)胞經(jīng)40ⅢviSFN處理后，采用分光光度法檢測(cè)Caspase．3，8，9在不同時(shí)間點(diǎn)的活性的變化。并且采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)Caspase抑制劑Z．VAD．FMK預(yù)處理后，SFN誘導(dǎo)ACC．M細(xì)胞凋亡情況，從而研究Caspase．3，8，9在SFN誘導(dǎo)ACC．M細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用，探討其可能的機(jī)制，并為臨床上治療涎腺腺樣囊性癌提供理論依據(jù)。材料和方法：1材料ACC．M：上海交通大學(xué)口腔頜面外科實(shí)驗(yàn)室提供，建立于1995年；Caspase．3，8，9活性檢測(cè)試劑盒及廣譜Caspase抑制劑Z．VAD．FMK：購(gòu)自碧云天生物技

4、術(shù)研究所；SFN：購(gòu)自美國(guó)LKT實(shí)驗(yàn)室，純度≥98％；細(xì)胞凋亡試劑盒(Annexin．V-FITC／PI試劑盒)：購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。中文摘要2方法2．1藥液配制SFN：用DMSO配制成1009M儲(chǔ)存液，．20。C冰箱儲(chǔ)存。使用前用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋。Caspase抑制劑Z．VAD．FMK的配制：將20止Caspase抑制劑Z．VAD．FMK(20mM)放入4mLDMSO溶液中，配成1001．tM儲(chǔ)存液混勻后適當(dāng)分裝備用。2．2細(xì)胞培養(yǎng)：采用加入10％胎牛血清和青霉素(100U／mL)、鏈霉素(100pg／mL)的RPMIl640培養(yǎng)基，在37。C、

5、5％C02恒溫箱內(nèi)飽和濕度下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞爬滿瓶底壁的80％時(shí)以0．04％EDTA和0．25％胰蛋白酶(1：1)混合液消化傳代。2．3分光光度法檢測(cè)Caspase．3，8，9活性：先利用pNA標(biāo)準(zhǔn)品制作出pNA濃度相當(dāng)于A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成2．0x105／mL細(xì)胞懸液接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入濃度為40pM的SFN2mL。繼續(xù)培養(yǎng)Oh(對(duì)照組)、4h、8h、16h和24h，收集細(xì)胞后以PBS洗滌一次，吸盡上清液，按照每20×105個(gè)細(xì)胞加入1009L裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解，離心后收集上清，即為待測(cè)樣本。分

6、別將10止待測(cè)樣本，80此檢測(cè)緩沖液，10止Ac．DEVD—pNA(或Ac．IETD．pNA或Ac．LEHD．pNA)置于96孔板中，并設(shè)空白對(duì)照。將96孔板置于酶標(biāo)儀上測(cè)定A405，通過(guò)與A405標(biāo)準(zhǔn)鹽線的對(duì)比就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA。然后分別繪制以時(shí)間為橫軸，pNA的量為縱軸的Caspase．3，8，9活性圖。2．4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)分三組，先用最終濃度為50州的Caspase抑制劑Z．VAD．FMK預(yù)處理細(xì)胞2h，再用409MSFN處理細(xì)胞24小時(shí)作為實(shí)驗(yàn)組(SFN+Caspase抑制劑組)。以0．04％DMSO處理細(xì)胞24小時(shí)作為陰性對(duì)照組

7、(DMSO組)。以409MSFN處理細(xì)胞24小時(shí)作為陽(yáng)性對(duì)照(SFN組)。獲取細(xì)胞后，Annexin．V-FITC和PI雙標(biāo)記活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三遍，使用SPSSl3．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)pNA含量和細(xì)胞凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。中文摘要結(jié)果：1分光光度法檢測(cè)Caspase．3活性：在SFN誘導(dǎo)ACC．M細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase．3的活性有明顯升高，在16小時(shí)達(dá)到高峰，之后有所下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各時(shí)間組與空白對(duì)照組(Oh)相比，均有顯著性差異(OhVS4h：P<0．01；OhVS8h：P<