萊菔硫烷對涎腺腺樣囊性癌細胞系acc-m增殖和凋亡的影響

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1、河北醫(yī)科大學碩士學位論文萊菔硫烷對涎腺腺樣囊性癌細胞系A(chǔ)CC--M增殖和凋亡的影響姓名：莊志征申請學位級別：碩士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學指導教師：張英懷；賈志宇201203中文摘要萊菔硫烷對涎腺腺樣囊性癌細胞系A(chǔ)CC．M增殖和凋亡的影響摘要目的：涎腺腺樣囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma，SACC)作為一種最常見的惡性腫瘤，以極強的浸潤性和高遠處轉(zhuǎn)移率為重要特征，發(fā)病率在口腔頜面部惡性腫瘤中居第二位。目前臨床治療手段以手術(shù)切除治療為主，但手術(shù)切除后也常有局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，其遠端轉(zhuǎn)移率在口腔頜面部居首位。涎腺腺樣囊性

2、癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機制目前仍不清楚。因此探索新的治療方法，以提高對腺樣囊性癌的療效，減少局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，改善患者的生存質(zhì)量顯得尤為必要。萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是主要從十字花科蔬菜中提取的一種具強抗癌作用的植物化學活性物質(zhì)，近年來相繼有研究顯示萊菔硫烷及其主要成分具有抗腫瘤的作用，但萊菔硫烷是否有誘導人腺樣囊性癌細胞凋亡的作用，國內(nèi)外尚未見報道。本研究擬對體外培養(yǎng)的人涎腺腺樣囊性癌ACC．M細胞經(jīng)不同濃度、不同時間萊菔硫烷作用后，觀察不同濃度、不同作用時間下萊菔硫烷對人涎腺腺樣囊性癌ACC．M細胞系是否具有抑制其增殖和

3、誘導其凋亡的作用，探討其可能的分子作用機制，旨在為腺樣囊性癌的多模式治療中拓展新的植物化學藥物治療提供實驗資料。方法：1材料1．1ACC．M：上海交通大學口腔頜面外科實驗室提供，建立于1995年；1．2萊菔硫烷(SFN)：購自美國LKT實驗室，純度≥98％2方法2．1藥液配制：萊菔硫烷用二甲基亞砜溶解配制成100mmol／L儲存液，使用前用RPMll640培養(yǎng)液稀釋。2．2細胞培養(yǎng)：培養(yǎng)液采用RPMll640加入10％的胎牛血清和鏈霉素(100lxg／mL)、青霉素(100U／mL)，置37℃、5％C02恒溫恒濕箱培養(yǎng)，約72．96小時可以傳代

4、。2．3MTT比色試驗：取對數(shù)生長期細胞經(jīng)消化液(O．04％EDTA和0．25％胰蛋白酶(1：1)混合液)消化后制成5．0x104個／mL細胞懸液，接種于中文摘要96孔板，每孔1009l，培養(yǎng)24h后，分別加入含萊菔硫烷溶液200I_tl，使各孔藥液終濃度為5州、101AVI、209M、309M、40州、601aM、80rtM、100I^M，并設(shè)對照組和調(diào)零孔，每組6個復孔。置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，在分別培養(yǎng)24、48、72小時后，使用微量移液器予每孔加入濃度為Sg／L的MTT溶液20山，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，予每孔加入2001A二甲基亞砜，于振蕩

5、器上振蕩搖勻約15分鐘，放入酶標儀(490nm)測定各孔吸光度值，重復三次，取均值計算生長抑制率。2．4臺盼藍拒染實驗：取對數(shù)生長期細胞制成5．0x104個／mL細胞懸液，接種于6孔板，每孔3mL，培養(yǎng)24h后，分別加入萊菔硫烷溶液，使終濃度為201JM、401xM，設(shè)對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72小時后以臺盼藍染液處理，在規(guī)定時間內(nèi)分別計數(shù)各濃度時間的染色細胞(即死亡)與未染色細胞(即活細胞)的數(shù)量，進行統(tǒng)計分析。2．5倒置相差顯微鏡觀察：制備密度約為5．O×104個／mL細胞懸液，于50mL玻璃培養(yǎng)瓶中接種細胞，經(jīng)培養(yǎng)，加藥后分別觀察細胞

6、在對照組與含藥培養(yǎng)液中(5州、101．tM、20?vl、301AVI、401aM、60kdVl、80州、1001xM)，各時間組(24h、48h、72h)的生長狀況。2．6光鏡觀察：制備密度約為5．O×104個／mL細胞懸液，于6孔板中放置玻璃蓋玻片后接種細胞，置恒溫箱培養(yǎng)，待細胞爬片成功，加入不含或含藥培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，Giemsa染色，置光鏡下觀察。2．7電鏡觀察：將細胞接種于50mL培養(yǎng)瓶中貼壁成功后加入空白或濃度為409M的含萊菔硫烷培養(yǎng)液，處理48h后，制備電鏡標本，觀察正常與凋亡細胞的結(jié)構(gòu)差異。2．8流式細胞

7、術(shù)檢測：將細胞接種于50mL培養(yǎng)瓶中貼壁成功后加入空白或含藥培養(yǎng)液，經(jīng)消化，離心，PBS液洗滌后加入Annexin．V-FITC和PI試劑標記處理細胞，置流式細胞儀檢測，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。3統(tǒng)計分析匯總所得實驗數(shù)據(jù)，應用統(tǒng)計學方法對實驗所測得的數(shù)據(jù)計算分析。結(jié)果：1MTT比色試驗：萊菔硫烷可以顯著抑制ACC—M細胞的生長，生長抑制率最大值高達81．05％。經(jīng)計算，在同一處理時間的情況，含藥組各濃度的生長抑制率不同(尸

8、正相關(guān)關(guān)系。2臺盼藍拒染實驗：用藥組的活細胞比率隨用藥濃度和時間的增長呈明顯下降趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學分析，各時間組和各濃度組之間有統(tǒng)計學差異儼<0．01)，